论文部分内容阅读
目的:骨肉瘤来源于间叶组织,多发生在骨组织,是一种常见于青少年或儿童的恶性骨肿瘤,男性患者多于女性,它的病程进展快、肺部转移早、预后不良、易复发,甚至死亡。目前骨肉瘤的治疗包括通过手术措施尽量完整切除病灶以及围手术期的抗肿瘤的综合辅助治疗。新辅助化疗作为化疗的首选,其不仅可以增加手术的安全性,而且能够为患者量身定制合适的假体做好准备。但目前化疗的药物品种有限,常伴随明显的全身毒副反应,给患者带来痛苦,寻找更多有效、副作用小的药物以及阐明其作用原理势在必行。唑来膦酸是具有代表性的、副作用小的第三代二膦酸盐,它具有骨代谢调节的特性,在体外能够起到抑制破骨细胞活动的作用,进而导致破骨细胞调亡,所以能够抑制骨破坏活性增加诱发的骨质吸收。另外有研究显示,唑来膦酸还可以抑制或粘滞肿瘤细胞基质释放的多种刺激因子引起的破骨细胞活动增强和骨钙释放,从而减缓骨转移的进展和发生,并可一定程度上的导致骨肉瘤细胞的死亡。PI3K/AKT信号通路是参与多数细胞的分化调节、生长、繁殖的信号转导通路。AKT别称蛋白激酶B在活化后,继续激活它的下游因子（GSK-3β等）,起到调节细胞周期、凋亡的作用。糖原合成激酶3β是关键的糖原合成酶,依赖其底物的磷酸化调节多个重要的细胞信号通路。大量的研究结果表明GSK-3β在骨肉瘤中表达增高,抑制其活性骨肉瘤细胞凋亡发生改变。Wnt信号通路参与骨髓基质干细胞的分化与更新,影响成骨及破骨细胞的生成分化,调节骨骼修复,对骨骼的生长发育、再生、重塑起到关键作用。Wnt信号通路能够引起β-连环蛋白β-Catenin的降解复合体包括Axin、APC、CK1、GSK-3β等,使细胞内β-Catenin积累、游离的β-Catenin进入细胞核,从而调节基因表达。本文旨在研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响;唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后PI3K-AKT、Wnt信号通路相关重要蛋白、基因表达影响。研究方法:1、采用MTT法检测骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸后24、48、72h后细胞活力变化;在50%抑制率药物浓度时间作用后,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞活力变化。2、划痕实验明确骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸,24、48、72h后细胞侵袭迁移力及凋亡状态;3、透射电镜观察骨肉瘤MG-63细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;4、流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;5、蛋白印迹方法Western Blot检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后,随着唑来膦酸作用药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸100μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的蛋白表达情况。结果:1、MTT结果显示,骨肉瘤MG-63细胞随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞活力抑制率及凋亡程度增加,50%抑制率约为药物100μmol/L作用48h;单纯GSK-3β抑制剂组与对照组比较无明显差异,GSK-3β抑制剂+实验药物组结果能够抑制细胞活力,但与相同条件实验药物组比较具有保护细胞活力的作用。2、划痕实验结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞迁移能力受到抑制,细胞出现明显凋亡变化。3、透射电镜结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞结构完整;实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡明显,以实验药物组效果显著。4、流式细胞仪检测结果显示,骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞轻度凋亡,实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡程度明显,以实验药物组凋亡率更高。5、蛋白印迹方法Western Blot结果显示骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白结果表达相当;实验组及GSK-3β抑制剂+实验药物组的β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白表达下降,以实验组显著;骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后及100μmol/L作用24、48、72h后的结果显示,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达降低。结论:1、唑来膦酸在体外具有抑制骨肉瘤MG-63细胞生长、促进其凋亡的作用;2、唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后,GSK-3β下游的蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达降低;实验组给予GSK-3β抑制剂Li2CO3后,β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的表达较实验组升高,说明唑来膦酸通过GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。3、唑来膦酸可以使P-AKT、PGSK-3β表达下降,进而影响其下游蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达下调,说明唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。