miR-7-5p靶向REGγ抑制人乳腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡研究

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第一章REGγ在人乳腺癌细胞株和组织中的表达目的:探讨蛋白酶体激活因子3(Proteasome activator subunit3,REGγ/PSME3/PA28γ/Ki抗原)在人乳腺癌细胞系和人乳腺癌组织中的表达情况。方法:采用半定量RT-PCR和immunoblot检测REGγ在人乳腺癌细胞系中表达情况;采用immunoblot检测REGγ在人乳腺癌组织和相应癌旁组织中的表达情况;采用Oncomine微阵列芯片在线数据库(https://www.oncomine.org/)分析REGγ在人乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达水平结果:RT-PCR结果显示REGγ在人乳腺癌细胞系中广泛表达,非成瘤细胞株(HBL100和MCF10A)表达相对较低,immunoblot结果显示REGγ蛋白水平在MDA-MB-231相对最高;4对人乳腺癌组织/癌旁组织中,癌组织中REGγ的蛋白水平均显著高于癌旁组织;Oncomine数据库的结果显示,相对于正常乳腺组织,REGγ的表达在乳腺导管内癌和浸润性导管癌中均呈不同程度的上升。结论:REGγ的mRNA和蛋白水平在人乳腺癌细胞系和组织中均呈不同程度上升,可能在乳腺癌的进程中扮演重要的作用。第二章miR-7-5p靶向调节REGγ的表达目的:验证miR-7-5p可特异结合REGγ的3端UTR(untranslatedregions),且miR-7-5p可靶向调节抑制REGγ的蛋白表达。方法:通过real-time PCR检测miR-7-5p在人乳腺癌细胞株中的表达;双荧光素酶报告基因验证miR-7-5p特异结合REGγ3′UTR的可能性;real-time PCR和immunoblot验证miR-7-5p对REGγ mRNA和蛋白水平的调节作用;使用real-time PCR检测miR-7-5p和REGγ在人乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达,分析两者表达的相关性。结果:miR-7-5p在MDA-MB-231细胞中的表达最低;过表达miR-7-5p可显著抑制荧光素酶活性;miR-7-5p能促进REGγ mRNA降解和抑制REGγ蛋白翻译;相对于癌旁组织,miR-7-5p在人乳腺癌组织中表达显著下调,而REGγ的表达显著上升,两者在乳腺癌组织中的表达具有负相关性。结论:miR-7-5p可通过特异结合REGγ的3`UTR促进REGγ mRNA的降解以及抑制REGγ mRNA蛋白翻译,在人乳腺癌组织中,两者表达的负相关性提示miR-7-5p负向调控REGγ。第三章miR-7-5p在人乳腺癌细胞中的功能机制目的:通过过表达miR-7-5p,探讨miR-7-5p在人乳腺癌细胞中扮演的角色。方法:以miR-7-5p表达较低的MDA-MB-231,MCF7细胞为研究对象,瞬时转染miR-7-5p模拟物上调miR-7-5p在MDA-MB-231和MCF7细胞中的表达,检测miR-7-5p对MDA-MB-231和MCF7细胞增殖的调节作用,并进一步在MDA-MB-231细胞中验证miR-7-5p对细胞周期,细胞凋亡,克隆形成能力的调节作用。细胞周期和细胞凋亡通过流式细胞术进行检测。结果:Real-time PCR结果显示MDA-MB-231和MCF7细胞过表达miR-7-5p成功;CCK-8结果显示miR-7-5p可显著抑制MDA-MB-231和MCF7细胞的增殖;EdU染色显示miR-7-5p可显著降低MDA-MB-231和MCF7细胞的DNA复制,抑制增殖;克隆形成实验显示相对于对照NC组,miR-7-5p可显著抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡显示,相对于对照NC组,miR-7-5p可将细胞阻滞于G0/G1期,且促进MDA-MB-231的凋亡;immunoblot结果显示miR-7-5p可显著抑制REGγ的蛋白水平,促进周期相关调节因子p21和p27在细胞里的集聚及caspase3蛋白剪切,从而阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。结论:过表达miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞的增殖,抑制细胞周期于G0/G1期,促进细胞凋亡,在人乳腺癌中扮演“抑癌基因”的角色。第四章REGγ在人乳腺癌中的功能机制目的:利用shRNA敲减REGγ的表达,评价REGγ在人乳腺癌细胞中的功能,进一步验证miR-7-5p靶向REGγ的功能性。方法:通过shREGγ敲减MDA-MB-231细胞中REGγ的表达,利用real-time PCR检测REGγ敲减效果,进而评价REGγ的敲减对人乳腺癌细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡的调节作用。CCK8、平板克隆实验以及软琼脂克隆实验用来验证细胞增殖能力;流式细胞术用来检测细胞周期和细胞凋亡。结果:Real-time PCR结果显示shREGγ可显著降低MDA-MB-231细胞中REGγ的表达水平;相对于空载体组,shREGγ可显著降低MDA-MB-231细胞的克隆形成能力,阻滞细胞于G0/G1期,促进细胞凋亡,主要引起p21在细胞中的集聚及caspase3的剪切。结论:敲减REGγ的表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖;miR-7-5p可通过与REGγ的3′UTR特异结合,抑制REGγ蛋白翻译,抑制人乳腺癌细胞的增殖。
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