论文部分内容阅读
目的：建立用于检测A组链球菌、白喉杆菌以及嗜肺军团菌的多聚合酶链反应(PCR)方法。同时，为下一步呼吸道传染病多重PCR检测方法以及基因芯片检测方法的建立提供实验基础。方法：1、以A组链球菌致热性外毒素B基因(speB)、白喉外毒素B片段基因(toxB)以及嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子基因(mip)为PCR扩增靶序列，通过美国医学图书馆生物信息中心的blast窗口，验证其特异性及保守性；根据核酸芯片技术的要求设定引物设计条件，应用primer premier 5.0引物设计软件设计引物；采用常规PCR技术对实验菌株DNA样本进行扩增。2、选择系列鉴别菌株样本进行对比，以观察设计、建立的PCR检测方法的特异性。同时，将待检测菌株DNA模板以1：10梯度稀释，做PCR扩增，分析PCR方法的检测敏感性。结果：1、用PCR方法检测A组链球菌：以A组链球菌致热性外毒素基因speB为靶序列，设计的扩增引物对全部对照菌株的扩增结果为阴性，而全部A组链球菌参考株均能扩增出特异的345bp片段，其中包括三株猩红热链球菌，检测敏感性为6.5pg／μl DNA。2、用PCR方法检测白喉杆菌：以白喉外毒素基因toxB为靶序列，设计的扩增引物对全部白喉杆菌参考株(有毒株)均能扩增出特异的318bp片段，而全部对照株的扩增结果为阴性，检测敏感性为850fg／μl DNA。3、用PCR方法检测嗜肺军团菌：以嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子基因mip为靶基因，设计的引物对嗜肺军团菌14个血清型参考株均扩增出特异的340bp片段，而鉴别对照株包括三株非嗜肺军团菌均未扩增出任何片段。检测敏感性为2.6pg／μl Lp-DNA。结论：1、以speB基因为靶基因建立的A组链球菌PCR检测方法、以toxB基因为靶基因建立的白喉杆菌PCR检测方法以及以mip基因为靶基因建立的嗜肺军团菌PCR检测方法均具有高度的特异性和敏感性，为三种病原体的快速、早期诊断提供了一种便捷、准确、可靠的技术。由于时间的限制，所建立的三种PCR检测方法目前还只处在实验室验证阶段，其对临床标本的检测及其准确度评价有待进一步开展。2、本实验PCR引物的设计、反应条件的选择均按照基因芯片技术的要求进行，为下一步呼吸道传染病多重PCR检测方法以及基因芯片检测方法的建立提供一定的实验基础。