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目的:1.明确电针对宫腔粘连模型大鼠的子宫内膜修复治疗效应。2.明确子宫内膜干细胞外泌体在电针修复宫腔粘连模型大鼠子宫内膜的治疗靶点作用,初步揭示电针治疗宫腔粘连模型的效应机制。方法:实验一、将45只雌性SD大鼠按随机数字表法随机分为3组,空白组、模型组、电针组各15只。通过机械搔刮联合脂多糖感染双重损伤法建立大鼠宫腔粘连模型。电针组在右侧子宫造模后第2天予以针刺“关元”、电针“子宫”“三阴交”,1次/d,15 min/次,连续干预2个动情周期;空白组、模型组予相同方法麻醉固定。各组随机选取5只雌鼠,分别于造模后第2个动情期过量麻醉后脱颈椎处死,取子宫组织;各组其余10只雌鼠,于造模后第2个动情期合笼,于妊娠第8天取出子宫组织,比较各组大鼠子宫内胚胎着床数目。HE染色法观察大鼠子宫内膜形态及腺体数目变化,Masson染色法观察大鼠子宫内膜纤维化面积,免疫组织化学法检测大鼠子宫内膜组织中Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1的蛋白表达,Western Blot法检测大鼠子宫内膜组织中整合素αγβ3的蛋白表达。实验二、将45只雌性SD大鼠按随机数字表法随机分为3组,空白组、模型组、电针外泌体(electroacupuncture exosomes,EA-exo)组各15只。造模方法同实验一。另有10只雌性SD大鼠造模后连续电针干预2个动情周期,取出子宫组织并提取、分离EA-exo,通过透射电镜、纳米颗粒示踪分析、Western Blot法进行鉴定。EA-exo组于动情期右侧子宫造模后进行EA-exo移植。各组随机选取5只雌鼠,分别于造模后第2个动情期过量麻醉后脱颈椎处死,取子宫组织;各组其余10只雌鼠,于造模后第2个动情期合笼,于妊娠第8天取出子宫组织,比较各组大鼠子宫内胚胎着床数目。HE染色法观察大鼠子宫内膜形态及腺体数目变化。结果:1.电针对宫腔粘连大鼠子宫内膜修复的效应研究(1)各组大鼠子宫内膜形态及腺体数目比较:空白组大鼠动情期的子宫组织结构完整,可见清晰的内膜层,宫腔通畅,形态规则,内膜层腺体分布较为密集;模型组大鼠动情期的子宫内膜层连续性差,宫腔明显狭窄呈粘连状态,腺体稀疏;电针组大鼠动情期的子宫组织结构基本完整,部分区域新生腺体较多,趋近于正常。与空白组相比,模型组大鼠子宫内膜腺体数目明显减少(P<0.01);与模型组相比,电针组大鼠子宫内膜腺体数目显著增多(P<0.01)。(2)各组大鼠子宫内膜纤维化情况:空白组大鼠动情期子宫内膜见少量浅蓝色胶原纤维,呈梭形分布,排列规则;模型组大鼠动情期子宫内膜大量深蓝色胶原纤维生成,排列杂乱;电针组大鼠动情期子宫内膜可见少量蓝色胶原纤维,颜色变浅,恢复梭形排列。与空白组相比,模型组大鼠子宫内膜纤维化面积增大(P<0.01);与模型组相比,电针组大鼠子宫内膜纤维化面积明显减小(P<0.01)。(3)各组大鼠子宫内膜组织中Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达:在模型组中,棕黄色颗粒为Col-Ⅰ、TGF-β1阳性染色,上皮细胞及间质细胞均可见,质染及核染均可见。与空白组相比,模型组大鼠子宫内膜组织中Col-Ⅰ、TGF-β1蛋白表达均升高(P<0.01,P<0.01);与模型组相比,电针组子宫内膜组织Col-Ⅰ、TGF-β1蛋白表达均降低(P<0.01,P<0.05)。(4)各组大鼠子宫内膜容受性标志分子整合素αγβ3(Integrin αγβ3)的蛋白表达:与空白组相比,模型组大鼠子宫内膜组织中Integrin αγβ3蛋白表达下调(P<0.01);与模型组相比,电针组大鼠子宫内膜组织中Integrin αγβ3蛋白表达上调(P<0.01)。(5)各组大鼠胚胎着床情况:分别计数子宫未损伤侧及损伤侧胚胎数目,比较各组大鼠胚胎着床数。与空白组相比,模型组损伤侧子宫胚胎着床数明显下降(P<0.01);与模型组相比,电针组损伤侧子宫胚胎着床数明显增加(P<0.05)。2.电针调控子宫内膜干细胞外泌体对宫腔粘连的治疗效应研究(1)EA-exo的鉴定①透射电镜下外泌体形态:外泌体形态完整,大小不均匀,为典型的椭圆形囊泡,其外周清晰,可见膜状结构,囊泡内可见低密度物质。②纳米颗粒示踪分析检测外泌体粒径:大多数外泌体粒径范围在100-200 nm之间,峰值为123 nm,与外泌体理论值(30-200nm)相符。③外泌体特异性蛋白CD9、CD81的蛋白表达:Western Blot结果显示,外泌体表面特异性CD9、CD81蛋白存在表达,提示外泌体纯化效果较好。(2)各组大鼠子宫内膜形态及腺体数目比较:空白组大鼠动情期的子宫组织结构完整,内膜层清晰可见,宫腔通畅,形态规则,腺体丰富密集;模型组大鼠动情期的子宫内膜层连续性被破坏,宫腔狭窄,各壁呈现粘连状态,腺体分布稀疏;EA-exo组大鼠动情期的子宫组织结构基本完整,新生腺体较多。与空白组相比,模型组大鼠子宫内膜腺体数目明显减少(P<0.01);与模型组相比,EA-exo组大鼠子宫内膜腺体数目显著增多(P<0.01)。(3)各组大鼠胚胎着床情况:分别计数子宫未损伤侧及损伤侧胚胎数目,比较各组大鼠胚胎着床数。与空白组相比,模型组损伤侧子宫胚胎着床数明显下降(P<0.01);与模型组相比,EA-exo组损伤侧子宫胚胎着床数明显增加(P<0.01)。结论:1.电针能够改善宫腔粘连模型大鼠子宫内膜纤维化,提高子宫内膜容受性,促进子宫内膜修复,且有利于胚胎着床。2.子宫内膜干细胞释放的外泌体可能是电针治疗宫腔粘连的作用靶点之一。