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研究背景:人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）属于疱疹病毒科,是最为常见的先天性中枢神经系统感染的病原体。在先天性HCMV感染的胎儿中大约有5-10%在出生时可表现为严重的神经性损伤,如小头畸形及室周钙化等。迄今为止,HCMV先天性感染引起神经系统损伤的细胞和分子机制尚未阐明。研究已经证明,神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）与受体的表达及其相互作用与神经细胞的生长发育、分化和凋亡等密切相关。体外培养神经细胞的过程中,在培养基中停止添加NGF,可以诱导细胞凋亡或死亡。鉴于此,我们推测:HCMV感染可能通过改变NGF和受体的表达水平而影响神经细胞的正常形态和功能,导致细胞凋亡,是HCMV感染致神经系统损伤的机制之一。目的:1.研究HCMV感染对体外培养的神经胶质瘤细胞和神经母细胞瘤细胞凋亡的影响;2.研究HCMV感染对体外培养的神经胶质瘤细胞和神经母细胞瘤细胞NGF及其受体转录及表达的影响,以探讨HCMV致神经系统病变的可能机理。材料和方法:1.HCMV AD169毒株制备及滴度测定:用AD169毒株感染人胚肺二倍体细胞,待细胞病变超过80%时收取细胞,反复冻融取上清,分装后-86℃冻存。采用病毒空斑定量的方法,倒置显微镜观察,计数空斑数并计算病毒滴度。2.用HCMV感染人神经胶质瘤细胞系（U251）,感染神经瘤细胞6h后,用RT-PCR的方法检测HCMV IE基因的表达水平。倒置显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测,观察HCMV感染对神经胶质瘤细胞凋亡的影响。3.体外培养U251细胞,细胞感染病毒后1、3、5和7天收获细胞为实验组,同时收获正常细胞为对照组,半定量RT-PCR检测细胞内NGF的转录水平,免疫荧光法和Western blot检测U251细胞NGF蛋白的表达水平。4.体外培养人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）并感染HCMV 48h后,采用免疫荧光法检测HCMV IE和pp65蛋白的表达。分别在SH-SY5Y细胞感染病毒后2、4、6天收取细胞,流式细胞仪检测HCMV感染对神经母细胞瘤细胞凋亡的影响。Western blot检测SH-SY5Y细胞NGF及其受体P75NTR蛋白表达水平的变化。结果:1.HCMV分别感染人神经母细胞瘤细胞和人神经胶质瘤细胞3天后,可见细胞形态有明显变化,细胞突起逐渐萎缩变成球形细胞,5天后病变更加明显,细胞绝大部分变成圆形、椭圆形,胞体及胞核增大,胞质混浊,细胞透光性降低。7天时可见所有感染细胞均发生类似病变。2.RT-PCR的方法检测HCMV IE基因的表达用于证实HCMV感染U251细胞,成功建立了神经胶质瘤细胞的HCMV感染模型。病毒感染1天后细胞无明显变化,感染5天后细胞在G1峰左侧出现一个亚二倍体细胞群的峰（亚G1峰,即凋亡峰）,感染7天后细胞凋亡峰明显。病毒感染后细胞发生凋亡,且随病毒感染时间的延长,细胞凋亡明显增加。感染后5天和7天的细胞凋亡率分别为4.1%和42.6%。3.U251细胞感染病毒各时间段NGF的RT-PCR产物电泳带平均灰度比值1d、3d、5d无明显变化（分别为0.846±0.113,0.721±0.025和0.865±0.047）,与对照平均灰度值（0.884±0.176）比较无统计学意义（P>0.05）;感染病毒7d平均灰度比值（0.528±0.053）与对照平均灰度值比较有统计学意义（P<0.05）。4.免疫荧光和Western blot结果显示,U251细胞感染病毒后1-5天,细胞内NGF的表达没有出现明显变化,在第7天出现明显下调。5.免疫荧光检测HCMV IE和pp65基因的表达,证实HCMV有效感染SH-SY5Y细胞。病毒感染2天后细胞无明显变化,感染4天后细胞出现一个凋亡峰,感染6天后细胞凋亡峰明显。感染后4天和6天的细胞凋亡率分别为24.4%和36.2%。6.Western blot结果显示SH-SY5Y细胞感染病毒后,细胞内NGF的表达出现先升高后降低的变化;其受体P75NTR蛋白的表达随着感染时间的延长明显上调。结论:1.神经胶质瘤U251细胞和神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞均是HCMV的容许细胞;2.HCMV感染可分别诱导体外培养的神经胶质瘤细胞和神经母细胞瘤发生凋亡;3.HCMV感染可分别下调体外培养的神经胶质瘤细胞和神经母细胞瘤内源性NGF基因转录和蛋白表达;同时可上调神经母细胞瘤细胞受体P75NTR蛋白的表达。