研究背景胃癌（Gastric cancer,GC）和胆囊癌（gallbladder cancer,GBC）是消化系统常见的恶性肿瘤,其发病都具有明显的性别、地理位置等差异。且早期和中晚期患者的临床预后相差甚远。近年来,尽管包括手术技术,放、化学治疗,免疫、靶向等综合治疗水平的提高,但早期根治性切除手术仍然是目前可能治愈或延长胃癌和胆囊癌患者临床预后的最有效手段。由于胃癌和胆囊癌都具有发病隐匿、早期无明显临床症状,淋巴结浸润转移较早等特点,病人常于中、晚期确诊,丧失手术机会,导致临床预后较差。在临床上可以看到这样一种现象,具有不同遗传背景的肿瘤患者,即使拥有完全相同病理基础和采用完全相同的手术方式和术后的辅助治疗,也会出现差别甚大的临床预后,说明基因改变可以影响肿瘤患者的临床预后。因此,寻找能够影响胃癌和胆囊癌患者临床预后的基因改变的生物标志物并对其机制进行探索,有助我们更准确的了解胃癌和胆囊癌的发生发展机制,这为早期临床诊断及临床药物研发打下坚实的分子理论基础。PI3K-Akt通路参与细胞正常生理进程如细胞增殖、分化、凋亡、免疫、代谢等过程。PI3K-Akt通路的异常激活参与包括肿瘤在内的许多疾病的发生,它影响到肿瘤的发生、生长、侵袭、炎症和免疫调节、肿瘤微环境的形成等各个方面。前人的研究表明PI3K-Akt通路在胃癌和胆囊癌中都扮演着重要的角色。同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog,PTEN）抑制PI3K-Akt信号通路,在胃癌和胆囊癌中扮演着抑癌基因的角色并参与胃癌和胆囊癌的临床预后。多磷酸肌醇4位-磷酸酶Ⅱ型（inositol polyphosphate 4-phosphatase type II,INPP4B）是PI3K-Akt信号通路的另一抑制因子,在消化系统中除胃癌和胆囊癌未被系统研究外,在结直肠肿瘤,肝癌和胰腺癌等都有被研究。国外仅有一篇文献在胃癌上关于INPP4B移码突变导致INPP4B蛋白合成提前终止从而影响INPP4B蛋白功能的报道,而在胆囊癌中还没有被报道。此外,有研究报道PTEN抑制HIF-1A参与肿瘤血管的形成,HIF-1A通过调节INPP4B参与喉癌细胞的糖酵解代谢,INPP4B参与前列腺癌的血管形成等,但这在胃癌和胆囊癌的临床样本上都还未被研究。因此,本研究着重围绕（1）INPP4B在胃癌和胆囊癌中的临床意义;（2）INPP4B对胃癌和胆囊癌的功能机制研究;（3）INPP4B和HIF-1A在胃癌和胆囊癌中与血管形成的相关性分析及临床意义研究。一、INPP4B在胃癌和胆囊癌中的临床意义为了检测INPP4B在胃癌和胆囊癌中的表达情况及与临床预后的相关性,课题组在新鲜配对的胃癌组织和正常组织中采用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reactive,RT-q PCR）和蛋白免疫印迹（western blot,WB）的方法检测INPP4B在胃癌组织和正常组织中INPP4B信使RNA（messenger RNA,m RNA）和蛋白的表达水平;在前期制作的组织芯片上采用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）的实验方法检测INPP4B蛋白在组织中定位和表达并分析其临床意义。RT-q PCR结果显示:在37对新鲜冰冻的胃癌组织和正常组织中,肿瘤组织中75.68%（28/37）的INPP4B m RNA水平低于对应的正常组织,且平均表达水平低于正常组织（p=0.0204）;WB结果显示胃癌组织中INPP4B的蛋白水平低于正常组织。IHC结果显示:INPP4B蛋白主要定位于细胞质;INPP4B在胃癌组织中的阳性率40.45%（72/178）低于正常组织75.61%（31/41,p＜0.001）;INPP4B在胆囊癌组织中的阳性率45.67%（58/127）高于正常组织23.40%（11/47,p=0.008）。与临床参数关联性分析发现:在胃癌中,INPP4B与组织的分化程度（p=0.019）和TNM分期（p=0.033）相关,与肿瘤体积大小成弱的相关性（p=0.08）;在胆囊癌中,INPP4B表达只与组织的分化程度相关（p=0.026）。生存分析发现:在胃癌中,INPP4B的高表达在胃癌的大肿瘤体积（≥6cm）/低-未分化/TNM III-IV期组中表现出差的临床预后,但在小肿瘤体积（＜6cm）/高-中分化/TNM的I-II期组中表现出好的临床预后;在胆囊癌中,INPP4B的高表达在低-未分化组中表现出差的临床预后,而在高-中分化组中表现出好的临床预后。以上的实验结果提示:INPP4B在不同的肿瘤中表达水平不一致,并且INPP4B在不同的组织分级和临床分期中可能扮演矛盾的角色。二、INPP4B对胃癌和胆囊癌的功能机制研究结合上述实验结果,我们猜测INPP4B在胃癌细胞及胆囊癌细胞中可能发挥着重要的功能作用,为了进一步验证我们提出的假设,我们分别选取两株胃癌细胞（AGS和BGC-823）和两株胆囊癌细胞（GBC-SD和SGC996）进行细胞功能表型的研究。我们利用慢病毒感染的方法构建INPP4B稳定过表达和干扰的细胞株。细胞增殖实验和克隆形成实验用于检测INPP4B对肿瘤细胞生长增殖的影响;凋亡实验用于分析INPP4B对肿瘤细胞凋亡的影响;划痕实验和Transwell实验用于分析INPP4B对肿瘤细胞运动迁移的影响。WB用于检测Akt、p-Akt、SGK3和p-SGK3等PI3K-Akt及SGK3通路中关键因子的水平变化,分析INPP4B在不同的肿瘤细胞可能通过那条通路发挥的功能作用。增殖和克隆形成实验结果表明:在胃癌细胞中,过表达INPP4B未能明显改变AGS细胞的生长增殖能力,干扰INPP4B可以显著抑制BGC-823细胞的生长增殖能力;在胆囊癌的GBC-SD和SGC996细胞也观察到相似的结果,干扰INPP4B可以显著抑制这两株细胞的生长增殖能力,而过表达INPP4B对这两株细胞的生长增殖能力的影响较小。凋亡实验结果显示,在胃癌细胞中,过表达INPP4B可以降低AGS细胞的凋亡率,干扰INPP4B可以增加BGC-823细胞的凋亡率;在胆囊癌的SGC996细胞也观察到相似的结果,而在GBC-SD细胞中无论是过表达还是干扰INPP4B其凋亡率都增高,只是干扰变化的更加显著。划痕实验和Transwell实验结果显示:无论是胃癌细胞（AGS和BGC-823）还是胆囊癌细胞（GBC-SD和SGC996）,过表达INPP4B可以使这些肿瘤细胞运动迁移能力增强,干扰INPP4B可以使这些肿瘤细胞运动迁移能力减弱。WB结果显示:过表达INPP4B增强了胃癌的AGS细胞中SGK3的磷酸化（p-SGK3）水平,但不影响Akt的磷酸化（p-Akt）水平;而干扰INPP4B增强了胃癌的BGC-823细胞中p-Akt的水平,但p-SGK3的水平没有明显变化;在胆囊癌的GBC-SD细胞中,过表达INPP4B增强了p-SGK3和p-Akt表达水平,干扰INPP4B降低了p-SGK3和p-Akt表达水平;在胆囊癌的SGC996细胞中,过表达INPP4B增强了p-SGK3表达水平,p-Akt表达水平未见显著变化;干扰INPP4B对p-SGK3和p-Akt表达水平均未见显著改变。这些结果表明INPP4B在胃癌细胞和胆囊癌细胞中扮演着促癌基因的角色,并在不同的肿瘤细胞中可能通过不同的信号通路影响其功能作用。三、INPP4B和HIF-1A在胃癌和胆囊癌中与血管形成的相关性分析及临床意义研究INPP4B在胃癌和胆囊癌中的表达和临床意义在第一部分已经详细叙述,这部分主要讨论INPP4B与血管形成和HIF-1A之间的关系。CD34表达于血管内皮细胞,通过CD34免疫组化染色来分析微血管密度（MVD）。胃癌组织中INPP4B阳性组（INPP4B+）的MVD（86.24±5.596）低于INPP4B阴性组（INPP4B-）的MVD（108.1±6.337,p=0.016）;而在正常胃组织中,INPP4B+组的MVD（80.65±10.64）和INPP4B-组的MVD（74.10±11.18,p=0.744）无显著差异;胆囊癌组织中INPP4B+组的MVD（139.5±9.910）稍高于INPP4B-组的MVD（127.8±11.36,p=0.447）,但差异未达到统计学意义;而在正常胆囊样本中,INPP4B+组的MVD（225.4±15.04）显著高于INPP4B-组的MVD（168.4±11.01,p=0.012）。HIF-1A在肿瘤的血管形成和临床预后中扮演着至关重要的作用,在胃癌的组织芯片中研究发现,HIF-1A蛋白定位于胃癌组织和正常胃组织的细胞质或/和细胞核中,胃癌组织中胞质HIF-1A的阳性率（35.39%,63/178）低于正常胃组织的阳性率（51.22%,21/41,p=0.06）,尽管数据未达到统计学意义;胃癌组织中胞核HIF-1A的阳性率（38.20%,68/178）显著高于正常胃组织的阳性率（2.44%,1/41,p＜0.001）,相关性分析发现胃癌组织中HIF-1A胞质和胞核表达呈现负相关性（r=-0.324,p＜0.001）;胃癌组织中,胞核HIF-1A阳性（HIF-1A+）组的MVD（114.4±8.073）高于胞核HIF-1A阴性（HIF-1A-）组的MVD（89.87±5.046,p=0.007）,胞质HIF-1A+组的MVD（95.52±7.755）和胞质HIF-1A-组的MVD（101.3±5.463,p=0.538）无明显差异;正常胃组织中,胞质HIF-1A+组的MVD（88.38±14.79）稍高于胞质HIF-1A-组的MVD（69.25±7.473,p=0.262）,但差异未达到统计学意义;Cox比例风险回归和Kaplan-Meier生存分析发现胞核HIF-1A+组胃癌患者的临床预后较胞核HIF-1A-组患者的更差,胞质HIF-1A+组胃癌患者的临床预后较胞质HIF-1A-组患者的更好。这些研究结果表明HIF-1A调节胃癌血管形成并参与胃癌患者的临床预后。在胆囊癌的组织芯片中研究发现,HIF-1A蛋白定位于胆囊癌组织和正常胆囊组织的细胞质或/和细胞核中,正常胆囊组织中胞质HIF-1A+（65.96%,31/47）和胞核HIF-1A+（36.17%,17/47）都分别高于胆囊癌组织（40.94%,52/127,p=0.003;21.26%,27/127,p=0.045）,相关性分析发现胆囊癌组织中HIF-1A胞质和胞核表达不相关（r=0.137,p=0.124）,而正常胆囊组织中HIF-1A胞质和胞核表达呈现负的相关性（r=-0.370,p=0.010）;胆囊癌组织中胞核HIF-1A+组的MVD（175±17.020）高于胞核HIF-1A-组的MVD（121±7.540,p=0.002）,胞质HIF-1A+组的MVD（138±10.360）和胞质HIF-1A-组的MVD（129±9.867,p=0.520）无明显差异;正常胆囊组织中胞核HIF-1A+组的MVD（146±20.910）低于胞核HIF-1A-组的MVD（201±7.834,p=0.005）,胞质HIF-1A+组的MVD（197±8.836）高于胞质HIF-1A-组的MVD（151±21.370,p=0.022）;Cox比例风险回归和Kaplan-Meier生存分析发现胞核HIF-1A+组胆囊癌患者的临床预后较胞核HIF-1A-组患者的更差,胞质HIF-1A对胆囊癌患者临床预后的影响较小。这些研究结果表明HIF-1A调节胆囊癌血管形成并参与胆囊癌患者的临床预后。HIF-1A和INPP4B的相关性分析发现,在胃癌组织中INPP4B与胞质HIF-1A成正相关（r=0.219,p=0.003）,与胞核HIF-1A无相关性（r=-0.011,p=0.885）;在正常胃组织中INPP4B与胞质HIF-1A成正相关（r=0.783,p＜0.0001）;在胆囊癌组织中INPP4B与胞质HIF-1A（r=0.139,p=0.120）和胞核HIF-1A（r=0.037,p=0.679）都无相关性;在正常胆囊组织中INPP4B与胞质HIF-1A成正相关（r=0.412,p=0.004）与胞核HIF-1A成负相关（r=-0.319,p=0.029）。上述结果表明,INPP4B与HIF-1A存在相关性但不同组织相关性不同。结论归纳:我们首先发现INPP4B在胃癌组织中低表达在胆囊癌组织中高表达,说明INPP4B在不同肿瘤中的表达水平是变化的;在分析INPP4B与临床预后的关系时发现,INPP4B参与胃癌和胆囊癌患者的临床预后但对不同病理组织级别发挥着促进或抑制肿瘤进展的双重作用,说明在不同的病理组织级别上INPP4B扮演着不同的角色;此外,体外的细胞功能实验发现INPP4B可能通过影响不同的信号通路促进肿瘤细胞的生长增殖和迁移运动能力以及抑制肿瘤细胞的凋亡等,扮演着促癌基因的功能作用;最后,在胃癌和胆囊癌组织样本中发现INPP4B、HIF-1A和CD34之间存在错综复杂的关系网络。本课题首次阐述了INPP4B在胃癌和胆囊癌中的临床意义、功能作用和初步的机制探索,为INPP4B基因在胃癌和胆囊癌上的临床治疗提供新的思路和坚实的分子理论基础。