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目的糖尿病易于产生慢性脑低灌注而引起神经系统退行性病变和认知功能障碍,神经元的损伤被认为是导致认知障碍的重要原因。目前研究表明自噬功能的异常参与了阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发生和发展,但在糖尿病慢性脑低灌注所致的认知功能障碍中,自噬所发挥的作用有待进一步研究。本实验使用低氧和（或）高糖体外培养小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2a,模拟糖尿病慢性脑低灌注疾病状态,探究自噬和线粒体自噬在细胞损伤过程中所发挥的作用。方法1.我们将Neuro-2a细胞分别置于正常氧浓度（21%O2）和低氧（1%O2）环境中,同时在各自氧浓度下又将细胞分为正常葡萄糖浓度（Control,25mM）和高糖浓度（High Glucose,100mM）进行培养。2.使用光学相差显微镜观察Neuro-2a细胞在低氧和（或）高糖环境下培养12h、24 h和48 h后的细胞形态改变,同时使用MTS检测在对应时间点处Neuro-2a细胞的增殖能力,采用Western blot免疫印迹技术检测细胞内凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的相对表达量。3.利用免疫印迹技术检测低氧和（或）高糖对Neuro-2a细胞内自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、P62蛋白表达的影响,利用细胞免疫荧光技术检测不同条件下细胞胞质内LC3B蛋白的表达和分布情况,并通过透射电镜观察细胞内的自噬泡。4.加入自噬抑制剂Bafilomycin A1处理各条件下的细胞,检测自噬相关指标的变化。5.使用JC-1装载处理后的Neuro-2a细胞,利用荧光显微镜和流式细胞学技术检测低氧和（或）高糖对Neuro-2a细胞内线粒体膜电位（ΔΨm）的影响。6.通过电镜观察低氧和（或）高糖处理后Neuro-2a细胞内线粒体结构的改变。7.Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、HIF-1α、BNIP3与线粒体标记蛋白TOMM20的相对表达量。8.利用细胞免疫荧光技术检测低氧和（或）高糖环境下Neuro-2a细胞内LC3B,BNIP3和线粒体（COXⅣ）的表达和分布及共定位情况。9.自噬抑制剂Bafilomycin A1处理后,检测线粒体自噬相关指标的变化。结果1.经低氧和（或）高糖培养48 h后,慢性低氧造成Neuro-2a细胞形态发生明显改变,MTS结果显示低氧导致细胞增殖能力下降,同时凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达升高,而高糖对Neuro-2a细胞的损伤作用不显著。2.Western Blot结果显示,慢性低氧致Neuro-2a细胞内LC3B-Ⅱ、P62蛋白水平显著的增加,高糖表现出轻度减弱低氧引起的LC3B-Ⅱ的升高,这一作用可能与高糖抑制了低氧条件下被激活的AMPK的活性有关。同时慢性低氧导致Neuro-2a胞质内呈点状聚集的绿色荧光LC3B蛋白明显增多的,透射电镜下也发现低氧处理后细胞内自噬泡的数目有所增加。3.Bafilomycin A1能明显增加正常氧Neuro-2a细胞内LC3B-Ⅱ、P62蛋白的表达,并显著造成Neuro-2a细胞死亡,但没有进一步影响低氧下Neuro-2a细胞的LC3B-Ⅱ、P62的蛋白水平,也没有加重低氧下细胞的损伤。4.荧光显微镜和流式细胞学技术检测发现低氧能显著降低Neuro-2a细胞内线粒体膜电位,透射电镜观察发现慢性低氧造成细胞内线粒体形态结构的改变,如线粒体的肿胀及线粒体膜和嵴的损伤。高糖对线粒体的损伤作用不显著。5.Western Blot结果显示,慢性低氧能引起Neuro-2a细胞内HIF-1α、BNIP3与线粒体标记蛋白TOMM20表达升高。6.细胞免疫荧光技术检测发现低氧下诱导增多的BNIP3与线粒体标记蛋白COXⅣ有明显的共定位,而LC3B鲜与线粒体标记蛋白COXⅣ和BNIP3共定位。7.Bafilomycin A1处理后,Western Blot检测发现阻碍自噬体降解没有显著影响BNIP3与TOMM20的蛋白表达水平。结论1.慢性低氧对Neuoro-2a细胞有明显的毒性作用,高糖仅能轻度加重低氧下细胞的损伤,但损伤作用不显著。自噬降解异常可能参与了Neuoro-2a细胞的损伤过程。2.慢性低氧造成了Neuoro-2a细胞内线粒体的损伤,相比而言高糖的毒性作用不明显。BNIP3介导的线粒体自噬途径障碍可能参与了细胞内受损线粒体的积聚。