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三裂叶蟛蜞菊(Wedelia trilobata)被世界保护联盟(IUCN)列为“世界最有害的100种外来入侵种”之一。我们前期的研究表明,三裂叶蟛蜞菊比蟛蜞菊(W.chinensis)对高温具有更强的耐热性,但其中的分子机制尚不明确。本实验利用Illumina HiSeqTM 2500测序平台对三裂叶蟛蜞菊及蟛蜞菊在40℃高温处理20 h和常温28℃(对照)的叶片进行转录组测序,比较二者在高温胁迫下的基因表达差异,挖掘与三裂叶蟛蜞菊耐高温有关的功能基因,并对这些基因进行功能预测和代谢途径分析;同时,采用实时荧光PCR对转录组测序结果进行验证,并进一步分析了4种编码不同功能蛋白的基因在高温胁迫下的表达进程。主要研究结果如下:1、转录组测序共获得28.58 Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到6.52Gb。通过Trinity软件对所获得的reads进行组装总共获得492,983个转录本。对所获得的clean reads进行组装,结果共得到88,504条Unigene,其中Unigene的N50为1,488。将Unigene基因与CGO,GO,KEGG,KOG,Pfam,Swisspriot,nr数据库进行对比,最终总共获得57,851(占65.4%)个有注释信息的Unigene。2、使用RPKM标准化处理方法对两个蟛蜞菊高温胁迫前后的测序文库进行差异比较分析,三裂叶蟛蜞菊和蟛蜞菊分别有5,566个和4,429个基因表达发生了显著的变化。将差异基因进行GO功能注释,分别有1,837和2,413个基因映射到GO不同的节点。按照参与的生物过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)及细胞组分(Cellular component)对这些基因进行分类,发现两种蟛蜞菊的分类类似。在生物过程中,富集功能多的是代谢过程(三裂叶蟛蜞菊1,675个和蟛蜞菊1,311个)、细胞进程(1,321和1,006)和单细胞有机体进程(1,164和868)。分子功能类别中,富集功能多的是催化活性(1,237和925)、结合功能(1,121和840)等。细胞组分类别中,富集基因多的2级分类是细胞部分(1,029和863)、膜结构(806和682)等。说明了两种蟛蜞菊高温胁迫过程中存在大量参与调控代谢活动和细胞凋亡,增殖与分化,氧化还原酶反应,蛋白酶解反应,分子结合,转运蛋白,细胞膜结构合成和膜结合细胞器等过程的基因。结果还发现,两种蟛蜞菊有大量的共表达基因,其中包括268个共同上调基因和240个共同下调基因。3、对两种蟛蜞菊差异表达基因进行KEGG通道注释,发现参与内质网基因加工通路(三裂叶蟛蜞菊103个和蟛蜞菊76个),核糖体(38和96)、碳代谢(49和51)、光合作用(30和26)、氨基酸生物合成(40和52)、植物激素信号转导(39和34)等过程的相关基因都发生了不同程度的上调和下调,表明这些基因在两种蟛蜞菊高温胁迫调控等方面发挥着重要作用。4、根据转录组测序结果分析,选取了4个与植物耐热相关的差异表达基因,分别是CL9177Contig1(HSP伴侣家族蛋白基因)、Group2_Unigene_BMK.52427(Hsp20/alpha晶体蛋白家族蛋白基因)、Group1_Unigene_BMK.20387(Rubisco活化酶基因)、CL19212Contig1(甲硫氨酸甲基转移酶基因),采用实时荧光PCR法对其高温胁迫后3 h、12 h、20 h的基因表达水平进行了分析和验证。结果表明,以蟛蜞菊常温组作为对照,三裂叶蟛蜞菊和蟛蜞菊的CL9177Contig1分别在3 h(15.56)和12 h(4.9)达到最高,Group2_Unigene_BMK.52427分别在20 h(7.64)和12 h(5.96)达到最高,Group1_Unigene_BMK.20387分别在20 h(5.52)和12 h(3.43)达到最高,CL19212Contig1分别在3 h(6.35)和12 h(4.28)达到最高。上述4个基因在三裂叶蟛蜞菊的表达量均高于蟛蜞菊,与其具有更强的耐热性有关。