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乙酰羟酸合酶（AHAS）是支链氨基酸生物合成途径中催化第一个共同步骤的限速酶,由于其主要存在于植物、细菌、真菌中,而人体中并不存在,所以一直以来作为筛选除草剂、开发抗微生物药的靶点,因此对于AHAS催化机制的研究具有极大的应用价值。细菌源AHAS由具有催化活性的催化亚基（CSU）和具有调节作用的调节亚基（RSU）组成;由于单独的CSU也具备催化活性,因此在许多研究中仅制备CSU以方便开展工作。一直以来关于AHAS催化双底物反应的产物种类并未有全面而详细的报道,尤其双底物的反应复杂性使其催化机制研究较为困难,因此关于AHAS催化机制的细节还有许多尚未解决的难题。为克服已有的AHAS活性测定方法之缺点,本文采用以4-硝基邻苯二胺（NPDA）和2,4-二硝基苯肼（DNPH）为衍生化试剂的柱前衍生-高效液相色谱法（柱前衍生-HPLC法）,围绕大肠杆菌I型乙酰羟酸合酶催化亚基（Ec AHAS I-CSU）的克隆表达、活性测定、稳态动力学以及催化机制进行了研究。通过重新设计构建重组工程菌E.coli BL21（DE3）-p ET-28a（+）-ilv BN,表征得到了活性和稳定性更好的Ec AHAS I-CSU,该蛋白比活力为12?mol?min-1?mg-1,在4℃条件下保存两个月后活性下降30%,而在-80℃保存4个月后活性未见明显下降。采用柱前衍生-HPLC法对Ec AHAS I-CSU催化反应中的底物及可能产物均建立了标准曲线以有效定量,对该酶催化的反应活性进行检测和定量分析,并测定其稳态动力学参数。对于单底物反应:UV法测得乙偶姻产率80.2（4）,KmPyr=6.57 m M;柱前衍生-HPLC法测得乙偶姻产率80.8%,而2,3-丁二酮产率为18.4%（该部分产物紫外法无法测定）,丙酮酸消耗率99.6%,KmPyr=4.94 m M,由此可见后一方法能够更加准确地评价AHAS催化的反应。在此基础上我们利用柱前衍生-HPLC法对Ec AHAS I-CSU催化的双底物反应进行了评价,结果显示:丙酮酸和2-丁酮酸消耗率分别为99.72%,98.22%;产物产率:2,3-丁二酮2.44%,2,3-戊二酮5.76%,乙偶姻9.56%,2-羟基-3-戊酮10.38%,3-羟基-2-戊酮64.1%,4-羟基-3-己酮4.8%,3,4-己二酮0.6%,乙醛0.5%,丙醛0.84%。本文采用柱前衍生-HPLC方法,首次成功全面地分析了Ec AHAS I-CSU催化的反应中底物的消耗和产物组成情况的各自准确含量,为Ec AHAS I-CSU催化反应机制的研究打下了良好的基础;同时这也印证了关于AHAS催化产物的推测,完善了AHAS催化反应的产物谱。更重要的是,本研究对于不同来源的AHAS催化机制、催化细节的研究有极大的参考价值。