AHLs淬灭菌的筛选鉴定及其生物防治效果研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ypf0856
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微生物的前期研究多集中在个体行为,但随着群体感应(Quorum sensing,QS)现象的发现,人们对于微生物的行为认知发生了变化。QS指微生物依据群体感应信号分子的浓度来调控相关基因的表达,这些基因多与微生物重要的生物学功能有关。N-酰基高丝氨酸内酯(N-Acyl homoserine lactones,AHLs)为革兰氏阴性细菌的一类重要信号分子。群体感应淬灭(Quorum quenching,QQ)是基于群体感应现象提出的新型病害防治策略,是指通过抑制微生物对信号分子的合成、监测或通过对信号分子进行酶降解、修饰的途径来干扰群体感应,使致病菌与致病相关的基因难以表达,以此来防治病害。在利用QQ来防治病害的过程中,病原菌不会产生抗药性。因此,发现新的具有群体淬灭活性的菌株并用以植物病害的生物防治,为发展新型环境友好型植物病害防治手段提供思路和探索。本课题就是围绕AHLs筛选鉴定信号淬灭菌并研究其对植物病害的生防效果,主要研究结果包括以下几部分:(1)从新疆、广东、河北等地采集环境样本,以信号分子AHLs为唯一碳源,进行富集培养筛选。经过菌株的分离和纯化,最终得到367株能够在AHLs为唯一碳源的基础培养基上生长的菌株。利用报告菌株进行进一步的筛选,试验发现其中18株细菌是可以降解AHLs的淬灭菌,这些菌株分别属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、农杆菌属(Agrobacterium sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)和苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)。(2)根据实验结果,选择3株降解效果较好的淬灭菌株:D-2、W-7和XJ-10进行分类学鉴定。经形态学鉴定、16S rDNA、生理生化特征、Biolog鉴定系统等鉴定3株菌株分别为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)和不动杆菌(Acinetobacter schindleri)。(3)对这3株淬灭菌的底物谱及降解效能进行了探究。研究发现菌株D-2具有较宽的底物谱,对3OC6HSL、3OC8HSL、3OC12HSL均有降解效果。在测量淬灭菌D-2对3OC6HSL降解率实验中,3OC6HSL的降解与菌株D-2的生长呈正相关,在3OC6HSL的存在下,菌株生长没有滞留期,迅速进入生长对数期。菌株D-2在024h时具有最快的降解速度,在32 h时,3OC6HSL被完全分解。菌株硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)W-7具有降解3OC12HSL和DSF的能力。在测量淬灭菌W-7对3OC12HSL降解率实验中,3OC12HSL的降解与菌株W-7的生长呈正相关,在3OC12HSL的存在下,菌株生长没有滞留期,迅速进入生长对数期。菌株W-7在024 h时具有最快的降解速度,在48 h时,3OC12HSL被完全分解。不动杆菌(Acinetobacter schindleri)XJ-10只能降解3OC12HSL。针对菌株XJ-10测量了其在12 h和24 h时对3OC12HSL的降解率,分别为85.71%和98.8%。AHLs淬灭菌对AHLs降解率实验中,AHLs的降解与淬灭菌的生长呈正相关,在3OC6HSL的存在下,菌株生长没有滞留期,迅速进入生长对数期。结果表明,淬灭菌对AHLs有显著且快速的降解作用。(4)进行接种实验,评估菌株W-7、D-2和XJ-10对AHLs介导的致病菌群体感应的淬灭能力和实际生防效果。AHLs淬灭菌D-2对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora,Pcc)引起的马铃薯软腐病和胡萝卜软腐病具有一定的生物防治效果,淬灭菌D-2与致病菌共同接种较单独接种致病菌时软腐病病害症状明显减轻。拮抗试验证明,淬灭菌D-2与致病菌之间不存在拮抗作用,所以,这种生物防治效果不是通过菌株之间的拮抗作用达到的。AHLs淬灭菌株W-7和XJ-10对迪基氏菌(Dickeya zeae)EC1引起的马铃薯软腐病具有一定的生物防治效果,淬灭菌W-7和XJ-10分别与致病菌EC1共同接种较单独接种致病菌EC1时马铃薯病病害症状均明显减轻。接种试验也表明,淬灭菌D-2、W-7和XJ-10均为安全不致病的菌种。(5)初步探讨菌株D-2对AHLs的降解机制。利用报告菌株及AHLs在碱性条件下发生结构变化成为酰化高丝氨酸的特性,初步判断淬灭菌D-2是通过产生内酯酶来降解AHLs信号分子。同时,通过提取淬灭菌D-2细胞粗酶液并利用报告菌株确定该淬灭菌的降解活性主要来源于胞内酶的作用。此外,利用GC-MS检测C6HSL代谢产物,并推断出其代谢途径:C6HSL首先在内酯酶的作用下被酶解为酰基高丝氨酸,酰基高丝氨酸继续分解生成N-环己基-丙酰胺和丙酰胺,最终代谢为CO2+H2O。
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