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研究背景:心肌缺血是心血管疾病患者死亡的主要原因。心脏活动由自主神经调控。颈上神经节（Superior cervical ganglion,SCG）和星状神经节发出心交感神经支配心脏。心交感神经末梢释放去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）对心脏功能发挥调控作用。心肌缺血时,心脏感觉传入信息增强,影响颈部交感神经节神经元细胞活动,导致心脏交感传出神经冲动加强,使血压升高和心率加快,加重心肌缺血损伤。近年来,P2Y6受体在心血管疾病发展中的作用已受到诸多关注。P2Y6受体在血管损伤、血管钙化、动脉粥样硬化血管损伤和心肌收缩力增强中具有重要作用,这提示P2Y6受体可能是心血管系统疾病的潜在治疗靶点。研究发现P2Y6受体在感觉神经节中参与痛觉的传递,且在SCG神经元上表达,但其在心肌缺血损伤中的作用及机制并不清楚。目的:探讨P2Y6受体在心肌缺血引起的颈部交感神经节病理变化中的作用及其分子机制,有助于为缺血性心脏病防治的药物作用靶点提供新的实验基础。方法:动物实验方法:本研究通过结扎大鼠心脏冠状动脉建立心肌缺血模型。将50只SD大鼠随机分为正常对照组（Ctrl）、假手术组（Sham）、心肌缺血模型组（MI）、心肌缺血模型组加空载质粒对照组（MI+NC shRNA）和心肌缺血模型加P2Y6 shRNA组（MI+P2Y6 shRNA）。每组十只。心肌缺血建模第7天,分别舌下静脉注射P2Y6 shRNA和NC shRNA。（1）观察心电图和心肌HE染色变化确定心肌缺血模型是否构建成功;（2）使用动物血压器测量大鼠的血压和心率,观察心肌缺血模型组与对照组大鼠血压、心率的差异;（3）应用免疫荧光双标检测颈部交感神经节P2Y6受体是否与神经元标志物Neu N共表达于颈部交感神经节神经元细胞上;（4）应用实时定量PCR（Real-time PCR）检测颈部交感神经节P2Y6受体;（5）应用蛋白印迹法检测颈部交感神经节P2Y6受体,炎性因子白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）,NF-κB信号通路pp65和p65蛋白的表达;（6）酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）检测模型大鼠血清中去甲肾上腺素的释放量。细胞实验方法:采用化学性氧糖剥夺方法对PC12细胞进行培养,成功制备氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）模型后,将PC12细胞随机分为4组,分别是正常对照组（Ctrl）,氧糖剥夺模型组（OGD）,氧糖剥夺模型加P2Y6激动剂UDP（OGD+UDP）,氧糖剥夺模型加P2Y6抑制剂MRS2578（OGD+MRS2578）。实验内容:（1）Na2O4S2浓度和时间筛选:通过CCK-8法检测各浓度Na2O4S2（1、5、10、30、100 mmo/L）和各时间（0、4、12、24h）对细胞存活的影响,通过不同条件下处理的细胞形态和细胞活力选定氧糖剥夺最合适的建模条件;（2）实时定量PCR方法检测各组PC12细胞中P2Y6受体m RNA水平变化;（3）蛋白印迹方法检测各组PC12细胞中P2Y6受体、IL-1β、TNF-α、pp65和p65蛋白表达水平变化;（4）Elisa检测PC12细胞培养上清液中炎性因子IL-1β的释放量。结果:动物实验结果:（1）心电图和HE染色结果显示MI组心电图ST段明显升高,心肌细胞排列紊乱,对照组心电图及心肌结构正常,提示大鼠心肌缺血模型建模成功。（2）血压和心率结果显示:MI组大鼠的血压和心率均较Ctrl组升高（P＜0.01）,而应用P2Y6 shRNA可抑制MI处理引起的血压和心率的升高（P＜0.01）,NC shRNA则无抑制作用（P＞0.05）。（3）心交感神经放电结果显示:MI组大鼠较Ctrl组心交感神经放电幅度明显增大（P＜0.001）、放电频率加快,P2Y6 shRNA可降低MI组大鼠心交感神经放电幅度和频率（P＜0.001）,MI+NC shRNA组与MI组相比无明显差异（P＞0.05）。（4）酶联免疫吸附法测量大鼠血清中去甲肾上腺素含量,结果显示心肌缺血模型组大鼠血清中NE含量较对照组显著升高（P＜0.05）,P2Y6 shRNA明显降低心肌缺血大鼠血清中NE水平（P＜0.05）。（5）免疫荧光结果显示:MI组大鼠SCG P2Y6受体与Neu N的共表达水平较Ctrl组明显增强（P＜0.01）;与MI组相比,MI+P2Y6 shRNA组共表达水平降低（P＜0.01）;MI+NC shRNA组与MI组相比无明显差异（P＞0.05）。（6）实时荧光定量PCR结果表明,MI组大鼠SCG中P2Y6 m RNA水平较Ctrl组明显升高（P＜0.001）,P2Y6 shRNA显著降低MI组的P2Y6 m RNA水平（P＜0.001）,而NC shRNA则无此降低效应（P＞0.05）。（7）蛋白印迹结果显示,MI组大鼠SCG中P2Y6受体、IL-1β、TNF-α、pp65和p65蛋白表达水平较Ctrl组明显增加（P＜0.01）,P2Y6 shRNA显著降低MI组上述蛋白表达水平（P＜0.01）,而NC shRNA无此降低效应（P＞0.05）。细胞实验结果:（1）CCK-8结果显示,与0小时处理组比较,6h处理组细胞活力降至50%以下（P＜0.001）,12和24小时处理组PC12细胞的细胞活力与6h处理组无差异;与Ctrl组相比,1 mmol/L Na2O4S2处理的细胞活力在80%左右（P＜0.05）,5 mmol/L浓度的处理组细胞活力降至50%以下（P＜0.001）,10、30和100 mmol/L浓度的Na2O4S2处理PC12细胞的细胞活力与5 mmol/L浓度处理组无明显变化（P＞0.05）;在光学倒置显微镜下观察不同时间5 mmol/L浓度药物处理细胞形态,OGD 24 h细胞基本都出现皱缩,突触完全消失,胞体变圆。因此我们选定5 mmol/L Na2O4S2处理24小时PC12细胞为最适建模条件。（2）Real-time PCR结果表明,OGD组中P2Y6 m RNA水平较Ctrl组明显升高（P＜0.01）,OGD+MRS2578组显著低于MI组（P＜0.01）,MI+UDP组显著高于OGD组（P＜0.01）。（3）蛋白印迹结果表明,OGD组中P2Y6受体、IL-1β、TNF-α、pp65和p65蛋白表达水平较Ctrl组明显增加,OGD+MRS2578组中上述蛋白表达水平显著低于OGD组,OGD+UDP组与OGD组相比上述蛋白表达水平显著增加。（4）Elisa检测结果显示:与OGD组相比,OGD+UDP组PC12细胞上清液中IL-1β含量增加,差异有统计学意义（P＜0.001）;而OGD+UDP+P65抑制剂组细胞上清液中IL-1β含量与OGD+UDP组相比明显下降（P＜0.01）。结论:颈上神经节神经元P2Y6受体参与了心肌缺血所致的心交感神经病变,其分子机制涉及NF-κB通路及炎性因子IL-1β和TNF-α的释放。