【摘 要】
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本文主要针对锌离子在基因工程大肠杆菌表达卤醇脱卤酶过程中的重要影响进行了系统研究。 首先,通过摇瓶实验显著筛选出影响卤醇脱卤酶表达的金属离子——Zn2+,并确定其最
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本文主要针对锌离子在基因工程大肠杆菌表达卤醇脱卤酶过程中的重要影响进行了系统研究。 首先,通过摇瓶实验显著筛选出影响卤醇脱卤酶表达的金属离子——Zn2+,并确定其最优浓度为0.7mg/L; 其次,在50L罐中进行了上述摇瓶实验结果的放大研究,探索了分批发酵过程中锌离子的最佳添加时机和浓度,对动态变化数据进行分析发现:锌离子不仅可显著提高大肠杆菌的生理活性、比生长速率和营养物质消耗速率,还能有效提高卤醇脱卤酶的表达以及酶的纯度,在此基础上筛选出最优锌离子添加策略( pdr4),发酵开始时加入0.35mg/LZn2+,对数生长期快结束时(约8h)加入0.35mg/L,此策略下相比对照组,最大比酶活和最大酶活分别提高5.42%和9.8%; 第三,对 L-阿拉伯糖和 Zn2+的协同调节作用进行了关联研究,研究发现:添加锌离子的情况下,L-Ar添加含量为1‰时最佳,卤醇脱卤酶可以较好地积累和表达,而过量添加的 L-Ar主要作为碳源参与菌体体内的磷酸戊糖途径。 最后,进行了pH梯度诱导及分批补料发酵卤醇脱卤酶,使得大肠杆菌菌体表现出很强的生理活性,生长代谢非常旺盛,最大酶活比空白组提高了12.3%,并且比酶活的大幅度提升,最大比酶活达到36160U/mg,比空白组的最高比酶活整整提高了6.1倍,酶的纯度大大提高。本研究为卤醇脱卤酶的调控机理研究奠定了一定的基础,并可为工业大规模发酵生产卤醇脱卤酶提供了理论指导。
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