杏鲍菇是一种在我国被广泛栽培的食药兼备的真菌,具有丰富的营养价值和多种活性物质,如多糖、多酚、蛋白质、矿物质、维生素等。据报道,杏鲍菇多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、预防糖尿病及提高免疫力等诸多功效,但对其功效机理的研究不够深入,特别是对降脂机理的研究浅显。本论文以杏鲍菇子实体为原料,使用传统的水提醇沉法提取杏鲍菇子实体中的多糖(PEP)。通过纯化得到三种组分的多糖PEP1-A、PEP2-A和PEP3-A,并对其进行结构表征。鉴于初步体外抗氧化活性筛选的结果,选择抗氧化活性较好的多糖PEP进行抗疲劳和降脂活性研究;通过常规生化指标检测,肝脏和脂肪组织的形态学观察,发现PEP具有抗疲劳和降脂功效。通过LC-MS技术、蛋白免疫印迹法和qRT-PCR技术分别从代谢组学方面、AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)和ACC(乙酰辅酶A羧化酶)具体的蛋白和基因表达层面研究了 PEP降脂机制。发现PEP通过调节氨基酸、脂肪酸和其它内源性化合物变化,及它们所参与的多种代谢通路共同发挥作用来降脂;AMPK-ACC通路中PEP降脂机制是通过调节AMPK、ACC的蛋白和基因的表达水平起作用。具体研究结果如下:(1)优化了提取PEP的最佳工艺参数,测定了 PEP的水合性质,并通过分离纯化得到PEP1-A、PEP2-A和PEP3-A三种多糖组分,测定并比较了它们的多糖、蛋白、糖醛酸、硫酸基含量,发现纯化后的组分除多糖含量升高外,蛋白、糖醛酸、硫酸基含量都有所减少。通过单因素和响应面实验,得到PEP得率最高的工艺参数,当提取温度为80℃,提取时间为3 h、提取料液比为1:50(g/mL)时获得的杏鲍菇多糖得率最高,达到7.52%。测定PEP总糖、蛋白、糖醛酸含量分别为67.84%、4.42%、0.28%。PEP的水溶性是45.8%,持水力为19.7 g/g,膨胀力为24.00 mL/g。(2)初步表征了 PEP1-A,PEP2-A 和 PEP3-A 的结构。PEP1-A、PEP2-A和PEP3-A的单糖组成中都有不同含量的岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖四种单糖,其中葡萄糖含量最高,岩藻糖含量最少。此外PEP3-A含有1.39%的阿拉伯糖。紫外、红外结果表明PEP1-A,PEP2-A和PEP3-A都含有多糖的特征吸收峰。核磁共振结果表明PEP1-A、PEP2-A和PEP3-A都有吡喃糖环,PEP1-A糖残基通过β-糖苷键连接,PEP2-A和PEP3-A的糖残基通过α-糖苷键连接。甲基化结果表明PEP1-A的主链是由1,3-Glc(p)、1,4-Glc(p)、1,6-Gal(p)、1,6-Glc(p)连接而成,分支是 1,3,4-Glc(p)、1,2,6-Man(p)。PEP2-A的骨架是由 1,3-Glc(p)、1,4-Man(p)、1,6-Gal(p)连接,支链是 1,2,6-Glc(p)。PEP3-A 的骨架由 1,3-Glc(p)、1,6-Glc(p)、1,4-Man(p)、1,6-Gal(p)、1,6-Ara(p)连接,分支是1,3,6-Glc(p)、1,2,6-Glc(p)连接而成。扫描电镜观察得知,PEP1-A、PEP2-A和PEP3-A有相似的条形片状结构表征。由于自身带电荷、分子内作用力和多支链等原因在原子力显微镜下观察到PEP1-A、PEP2-A、PEP3-A是无规则团状、岛屿状和谷堆状。(3)杏鲍菇多糖体外抗氧化实验表明:在测定范围内,PEP、PEP1-A、PEP2-A、PEP3-A均具有一定的还原力、超氧阴离子自由基清除能力、羟基自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力。综合比较PEP的体外抗氧化能力较好。(4)抗疲劳活性中PEP对小鼠体重和肝脏指数变化没有显著影响,PEP对小鼠负重游泳时间的影响与正常对照组相比,杏鲍菇高、中、低剂量组小鼠的竭力游泳时间显著增加(p<0.05)。高、中、低剂量组竭力游泳时间的增加率分别为89.70%,75.12%和53.11%,其效果与实验范围内的灌胃剂量呈正相关。抗疲劳生化指标表明与对照组相比PEP干预组降低BUN(尿素氮)、LD(乳酸)水平含量,降低LDH(乳酸脱氢酶)活性。(5)不同剂量的PEP灌胃高脂小鼠,小鼠体重、生化指标和组织病理学切片都说明PEP具有降脂作用。阳性对照组和高剂量的PEP组能显著降低小鼠体重,中、低剂量的PEP组体重降低不显著,说明灌胃浓度对体重变化有影响。小鼠的生化指标和酶学检测结果表明,在辛伐他汀和不同剂量的PEP灌胃后,阳性对照组、不同剂量的PEP处理组和高脂模型组比较发现,TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸氨基转移酶)含量都显著降低,而HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)含量显著增高,其降低和升高程度与PEP含量呈剂量性关系。说明PEP具有降脂作用,能够预防食源性肥胖,且高剂量PEP降血脂的效果最好,中剂量PEP效果次之,低剂量PEP效果最低。小鼠肝脏和附睾脂肪组织形态学观察结果表明,不同剂量的PEP灌胃处理后,小鼠肝脏组织中的脂肪空泡的数量和体积与模型组相比均有所减少和变小;小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞体积大小和数目与高脂模型组相比都有所减少,其中高剂量PEP组作用最佳。(6)通过LC-MS技术对各组小鼠的血清样品进行代谢组学分析,从代谢组学的角度阐明PEP的降脂作用及机制。结果发现高脂模型组和不同剂量的PEP组血清代谢物的组间有较好的分离度,说明PEP对高脂小鼠有一定的降脂效果,可用于对高脂人群的预防和治疗。各组比较分析后寻找出PEP灌胃高脂小鼠后血清中代谢差异物包括氨基酸、脂肪酸、胆碱、脂质变异体和其他内源性化合物及所参与的代谢通路的变化。发现甘油磷脂代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢等多条通路发生改变,表明不同剂量的PEP对肥胖引起的高脂血症的改善可能与能量代谢相关。(7)对PEP介导的AMPK-ACC信号通路发挥的降脂作用进行了初步分析。采用Western blot和qRT-PCR技术分析AMPK-ACC通路中关键蛋白和基因的表达水平,发现PEP具有降脂作用是通过上调pAMPK和pACC的蛋白表达水平,及上调AMPK和ACC的基因表达水平来实现的,进而抑制高脂及并发症等代谢异常疾病的发生。通过本研究,发现杏鲍菇子实体多糖具有抗疲劳和降脂的生物活性,并初步分析了 PEP1-A,PEP2-A和PEP3-A结构。从代谢组学层面、AMPK及ACC蛋白和基因的表达水平层面阐明了 PEP降脂作用机制。为杏鲍菇多糖的深入研究和作为保健品的开发奠定了理论基础。