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肝脏是参与药物和毒物代谢的主要器官。肝脏结构和功能的基本单位为肝小叶,每个肝小叶中的肝脏细胞被分为中央静脉周肝脏细胞(PV)、汇管区周边肝脏细胞(PP)以及PP和PV中间的肝脏细胞。最近研究显示PP和PV细胞内的很多基因表达存在显著差异。为了细致研究肝脏不同分区的功能差异,有学者建立了洋地黄皂苷-胶原酶灌注方法分离PP和PV肝细胞。但是,此方法存在成本较高、纯度低和分离时间长等问题。因此,优化和改良肝脏不同分区肝脏细胞的分离方法显得非常重要。本研究对猪和小鼠肝脏PP和PV肝细胞分离方法进行了改进和优化,并且探讨了猪和小鼠不同分区肝细胞中异物代谢相关基因的表达异同。
主要研究内容如下:
1)统计猪和小鼠肝小叶中PP到PV间肝板细胞数量
采集成年猪和C57BL/6小鼠肝脏组织样本,H&E染色显示猪和小鼠正常的肝小叶组织形态。每个样本采集6个视野以上进行统计:猪PP到PV间肝板细胞平均为15个,小鼠PP到PV间肝板细胞平均为9个,差异显著。
2)优化并建立猪PP和PV肝细胞分离方法
使用洋地黄皂苷由门静脉或下腔静脉灌注,使得整个肝脏的PP或PV细胞被均匀地破坏。经筛选:洋地黄皂苷最适作用浓度为3.5mmol/L,最适作用时间为60s,并以此为基础分离出PP和PV肝细胞,细胞的存活率达到87%-90%。分区标记物Gs和Cyp7a1在PV的表达均显著高于PP,Pepck在PP的表达显著高于PV。存活率以及不同分区细胞标志物的表达结果显示,我们的方法均优于已有的报道,可得到较纯的PP和PV肝细胞。
3)改良C57BL/6小鼠PP和PV肝细胞分离方法
筛选出洋地黄皂苷最适作用浓度为5mmol/L,在此基础上分离PP和PV肝细胞,细胞的存活率为85%-90%,与已有文献报道相比,存活率提高了5%;经QRT-PCR检测:Oat和Cyp7a1在PV的表达显著高于PP,且上调倍数分别为9.0和17,比已有的文献报道中分别高出1.6和6.3倍;此外,我们也发现Gs在PV的mRNA和蛋白表达水平都显著高于PP,E-cad在PP的mRNA和蛋白表达水平都显著高于PV。因此,利用我们的方法,能得到更纯、活力更好的PP和PV肝细胞。
4)检测猪PP和PV肝细胞中异物代谢相关基因的表达差异
分离出的猪PP和PV肝细胞培养24h后提取RNA。通过QRT-PCR检测Cyp3a39和Ephx1在两种细胞中的表达,发现在PV中两个基因的表达均显著高于PP。由于异物代谢相关基因的表达受核受体调控,因此我们也检测了几种核受体的表达,发现FXR在PV的表达显著高于PP,PPARα在PP的表达显著高于PV。
5)检测C57BL/6小鼠PP和PV肝细胞中异物代谢相关基因的表达差异
利用我们改良的小鼠PP和PV肝细胞分离方法得到的细胞,培养24h后提取RNA,通过QRT-PCR检测Cyp27a、Cyp8b、Cyp2e1和Ces1g在两种细胞中的表达,发现四个基因在PV中的表达均显著高于PP,也发现FXR和PPARα在PV的表达显著高于PP;RXR在PP的表达显著高于PV。研究提示猪和小鼠的PP或PV区的肝脏细胞中的异物代谢相关基因表达存在物种差异。
主要研究内容如下:
1)统计猪和小鼠肝小叶中PP到PV间肝板细胞数量
采集成年猪和C57BL/6小鼠肝脏组织样本,H&E染色显示猪和小鼠正常的肝小叶组织形态。每个样本采集6个视野以上进行统计:猪PP到PV间肝板细胞平均为15个,小鼠PP到PV间肝板细胞平均为9个,差异显著。
2)优化并建立猪PP和PV肝细胞分离方法
使用洋地黄皂苷由门静脉或下腔静脉灌注,使得整个肝脏的PP或PV细胞被均匀地破坏。经筛选:洋地黄皂苷最适作用浓度为3.5mmol/L,最适作用时间为60s,并以此为基础分离出PP和PV肝细胞,细胞的存活率达到87%-90%。分区标记物Gs和Cyp7a1在PV的表达均显著高于PP,Pepck在PP的表达显著高于PV。存活率以及不同分区细胞标志物的表达结果显示,我们的方法均优于已有的报道,可得到较纯的PP和PV肝细胞。
3)改良C57BL/6小鼠PP和PV肝细胞分离方法
筛选出洋地黄皂苷最适作用浓度为5mmol/L,在此基础上分离PP和PV肝细胞,细胞的存活率为85%-90%,与已有文献报道相比,存活率提高了5%;经QRT-PCR检测:Oat和Cyp7a1在PV的表达显著高于PP,且上调倍数分别为9.0和17,比已有的文献报道中分别高出1.6和6.3倍;此外,我们也发现Gs在PV的mRNA和蛋白表达水平都显著高于PP,E-cad在PP的mRNA和蛋白表达水平都显著高于PV。因此,利用我们的方法,能得到更纯、活力更好的PP和PV肝细胞。
4)检测猪PP和PV肝细胞中异物代谢相关基因的表达差异
分离出的猪PP和PV肝细胞培养24h后提取RNA。通过QRT-PCR检测Cyp3a39和Ephx1在两种细胞中的表达,发现在PV中两个基因的表达均显著高于PP。由于异物代谢相关基因的表达受核受体调控,因此我们也检测了几种核受体的表达,发现FXR在PV的表达显著高于PP,PPARα在PP的表达显著高于PV。
5)检测C57BL/6小鼠PP和PV肝细胞中异物代谢相关基因的表达差异
利用我们改良的小鼠PP和PV肝细胞分离方法得到的细胞,培养24h后提取RNA,通过QRT-PCR检测Cyp27a、Cyp8b、Cyp2e1和Ces1g在两种细胞中的表达,发现四个基因在PV中的表达均显著高于PP,也发现FXR和PPARα在PV的表达显著高于PP;RXR在PP的表达显著高于PV。研究提示猪和小鼠的PP或PV区的肝脏细胞中的异物代谢相关基因表达存在物种差异。