D-阿洛酮糖作为一种热量低、口感好并且有多种生理活性的天然代糖产品,近年来市场需求激增。自然界中D-阿洛酮糖含量极其稀少,目前工业上主要利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase,DPE）催化D-果糖发生异构化反应来制备D-阿洛酮糖,其中生产DPE的成本占制备D-阿洛酮糖成本的很大比例。但是现有DPE普遍存在热稳定性差、储存稳定性差等问题,限制了D-阿洛酮糖的进一步工业化生产。本研究以解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum H10）来源的DPE（CcDPE）为研究对象,通过非理性定向进化分别获得了热稳定性和比活力提高的突变体,并对突变体进行了相关酶学性质的研究。然后对启动子PamyE的分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）区域进行改造,进一步提高发酵产量。最后通过添加稳定剂,解决了CcDPE不易储存的问题,为DPE的进一步工业化生产奠定了基础。本论文主要研究结论如下:1、分子改造提高CcDPE热稳定性与比活力。定向进化获得热稳定性提高的突变体A107P,并在其基础上进一步叠加具有协同效应的突变位点H56Q,构建突变体H56Q/A107P。在55℃条件下进行孵育6 h,野生型、A107P和H56Q/A107P的残余酶活分别为21.5%、47.5%、67.3%。推测位于loop环上的107位点突变为脯氨酸后,由于脯氨酸特殊的侧链结构,loop柔性减弱,酶整体结构的刚性加强,热稳定性得到提高。定向进化获得比活力提升的突变体L159M/H207L,分别构建突变体L159M、H207L。在60℃下,野生型、L159M和H207L的比活力分别为326.3、337.2和514.5 U·mg-1。H207L比活力明显提高至野生型的1.6倍。通过对突变体的三维模拟结构分析,发现H207L突变体与周围E34以及S240之间的氢键作用消失,影响了β2与β8折叠之间的牵引力,这可能是造成H207L突变体比活力提高但最适温度降低的主要原因。2、分子改造启动子PamyE的CRE区域优化CcDPE表达。在实验室前期构建的Bacillus subtilis CCTCCM 2016536/pHY300PLK-PamyE-ccdpe的基础上,对启动子的CRE区域进行改造,缓解发酵过程中的碳分解代谢物阻遏（carbon catabolite repression,CCR）效应。实验表明:通过破坏CRE区域的回文性、对称性或者改变其与目的基因的距离,可有效缓解CCR效应,其中突变体Δ109摇瓶发酵酶活力达到野生型的297.7%。构建B.substilus/p HY300PLK-Δ109-H207L,并在3-L发酵罐中高密度发酵。发酵进行到73 h时,总酶活为4567.4 U·m L-1,达到目前CcDPE发酵最高水平的2.0倍,进一步降低了生产成本。3、通过稳定剂提高CcDPE储存稳定性。大多数DPE常温下储存稳定性差成为了工业应用中的限制因素。本研究考察了糖类、金属离子与多元醇类等稳定剂对CcDPE的作用效果。结果表明:在25℃下,20%甘油与0.5 mmol·L-1 Co2+的复配组合可以将CcDPE半衰期从4.5 d延长至79.6 d;也可以将H207L储存15 d后的残余酶活,从9.7%提升至65.8%。研究结果为CcDPE的进一步工业化应用提供了技术支撑。