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研究目的急性早幼粒白血病(APL)是一种早期致死率非常高的血液疾病。目前APL临床治疗主要采用以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)为基础的化疗,但这种治疗方法的长期治愈率(5-year disease free survival)仅为74%。另外,ATRA治疗还存在着引发病人继发维甲酸综合症或脏器衰竭等其他问题。因而,通过调控异常信号分子或信号通路来引发白血病细胞凋亡的治疗方法将是对现有ATRA疗法的很好补充。亚硒酸钠能够特异诱导白血病细胞凋亡,对其机制的阐明将有助于发展APL治疗新方法,提高APL治愈率,甚至有益于其他白血病治疗。研究内容RhoA/ROCK1通路与肿瘤的发生发展密切相关,在许多肿瘤组织中该通路异常活化,阻断该通路能够抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡,因此RhoA/ROCK1通路是一个潜在的肿瘤治疗靶点。RhoA/ROCK1通路受到受体酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase, RTK)的调控。在白血病细胞中,多种RTK,包括KIT、FLT3、Bcr-ABL发生突变而过度活化,因而RhoA/ROCK1在白血病细胞中也可能异常活化。研究RhoA/ROCK1在APL中的活性将有助于发展特异性靶向治疗。RhoA/ROCK1调节多种底物信号分子,寻找与凋亡相关的信号通路,阐明RhoA/ROCK1通路是如何决定细胞命运将有助于靶向治疗效果的评估。本论文通过比较亚硒酸钠对白血病细胞与正常单核细胞的影响,对RhoA/ROCK1通路在白血病细胞中的活性、该通路与Erk1/2信号分子的关系,以及RhoA/ROCK1通路与Erk1/2通路调节细胞线粒体凋亡通路的机制进行了研究。研究方法本论文采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)与Western blot分别从mRNA水平与蛋白质水平上检验目的蛋白的表达变化与蛋白修饰的改变；通过化学修饰与基因表达调整来研究目的信号分子对细胞凋亡的影响；通过细胞免疫荧光、蛋白质共沉淀(Co-IP)和GST pull-down来研究蛋白质间相互作用；采用流式细胞术、透射电镜、线粒体膜电势测定与TUNEL染色来原位研究线粒体完整性与细胞凋亡；通过动物模型研究亚硒酸钠的整体毒性以及肿瘤治疗效果；采用免疫组织化学染色研究信号分子在动物模型中的变化。研究结果1.亚硒酸钠特异诱导白血病细胞凋亡。亚硒酸钠(20μM)诱导白血病细胞NB4与Jurkat发生线粒体通路介导的内源性凋亡。而正常人外周血单核细胞的生长与活性都未受亚硒酸钠影响。2. RhoA/ROCK1通路在白血病细胞中高表达。RhoA的表达与活性在白血病细胞中均较高。ROCK1的表达在白血病细胞与正常细胞中没有区别,但它的活性在白血病细胞中较高。3.ROS是细胞凋亡的主要诱因。亚硒酸钠处理后,NB4与Jurkat细胞中均检测到过氧化氢类ROS剧烈产生。50μM H2O2处理也诱导白血病细胞发生内源性细胞凋亡。4.抑制RhoA/ROCK1通路促进细胞凋亡。白血病细胞中,亚硒酸钠通过ROS产生下调RhoA与ROCK1的表达与活性。利用抑制剂与活化剂、siRNA与质粒,抑制RhoA/ROCK1通路活性增强亚硒酸钠引发的凋亡；活化RhoA/ROCK1通路则减轻细胞凋亡。另外,RhoA通过ROCK1调节细胞命运。正常单核细胞中,RhoA/ROCK1通路未受影响。5.亚硒酸钠诱导Erk1/2迅速活化。Erk1/2磷酸化呈现先急速上调再逐渐下调的趋势。其中,Erk1/2活性上升期对细胞凋亡影响较显著,提高Erk1/2磷酸化本底水平增强凋亡,降低磷酸化本底水平抑制凋亡；Erk1/2活性下调期对凋亡影响较小。ROS是Erk1/2活化的主要诱因。亚硒酸钠还促使Erk1/2向细胞核内转位。6. ROCK1是Erk1/2通路的scaffold分子。生物信息学分析显示ROCK1蛋白质序列中含有Erk结合结构域(Erk docking domain)。内源性蛋白质Co-IP以及GST pull-down实验显示ROCK1与Erk1/2间发生ROCK1活性依赖的分子结合。RhoA调节ROCK1-Erk1/2分子结合。7. RhoA/ROCK1通路与Mek1/2共同但相互独立地调节Erk1/2活性。Mek1/2在上游正调节Erk1/2活性。RhoA/ROCK1通路在Mek/Erk信号级联外负调节Erk1/2活性。RhoA/ROCK1通路与Mek1/2司无相互作用。抑制Mek1/2活性不能降低RhoA/ROCK1通路失活引起的Erk1/2活化与细胞凋亡。8. RhoA/ROCK1通路调节Erk1/2定位。RhoA与ROCK1均主要定位于细胞质中。白血细胞中,ROCK1能够结合Erk1/2, ROCK1又通过羧基端与细胞膜上的RhoA结合,从而将Erk1/2停留在细胞质中。当亚硒酸钠处理使RhoA失活后,ROCK1释放Erk1/2,后者向细胞核中转位。9. Erk1/2通过调节Bax影响细胞凋亡。敲低Bax表达抑制细胞凋亡。Erk1/2活化促进Bax表达与寡聚化,引起线粒体膜电势下调；抑制Erk1/2活性下调Bax表达与寡聚化。同样,RhoA也调节Bax表达。10.亚硒酸钠诱导移植瘤细胞凋亡。亚硒酸钠对正常小鼠的毒性较小。在接种NB4细胞的小鼠中,亚硒酸钠抑制肿瘤生长以及脾脏与骨髓中的病灶转移。TUNEL分析显示肿瘤组织发生凋亡。Western blot检测发现肿瘤组织中caspase9与caspase3活化。另外,Western blot与免疫组化实验证实RhoA-ROCK1-Erk1/2-Bax通路参与亚硒酸钠诱导的肿瘤细胞凋亡。结论1. RhoA/ROCK1通路在急性早幼粒白血病(APL)以及急性T细胞白血病(ATL)细胞中异常活化。抑制该通路,能够激活Erk1/2-Bax信号级联,诱导细胞发生内源性凋亡。RhoA/ROCK1通路是一个潜在的白血病治疗靶点。2.作为一种较为特异的促白血病细胞凋亡化合物,亚硒酸钠可能对APL临床治疗有益,是一种潜在的APL治疗药物。