胜红蓟内生真菌的分离鉴定、生物活性及其合成纳米银的研究

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植物内生真菌种类丰富,发酵产物具有抗氧化、抑菌以及提高植物抗逆性等功能,其分泌的蛋白质、糖类及功能酶等生物分子,具有温和且高特异性的氧化还原能力和结合、运输金属离子及价态转换的功能,在生物合成纳米颗粒方面具有独特的应用潜力。利用真菌生物合成纳米材料相比于传统的化学、物理合成方法,具有反应条件温和、绿色低毒、环境友好等优势。因此本研究首次分离和鉴定药用入侵植物胜红蓟(Ageratum conyzoides L.)的内生真菌,筛选具有抗氧化、抑菌及合成纳米银(Silver nanoparticles,AgNPs)的菌株,研究主要内容和结果如下:(1)采用常规组织块分离法从胜红蓟不同组织中共分离出25株内生真菌,其中根部6株、茎部7株、叶部5株、花部7株;结合形态学观察及ITS序列分析对25株真菌进行鉴定,鉴定为14属,其中以镰孢菌属(Fusarium)和间座壳属(Diaporthe)为优势属类群,结果为胜红蓟内生真菌的种类鉴定和资源的开发利用提供科学的依据,同时也达到资源化利用药用入侵植物胜红蓟(A.conyzoides)的目的。(2)对各菌株进行摇瓶发酵培养,所得发酵液用乙酸乙酯萃取,菌丝体抽滤至烘箱烘干,研磨细粉体,用乙酸乙酯超声提取三次,合并萃取液和超声提取液后浓缩获得各菌株的乙酸乙酯相粗提物,备用;采用DPPH、ABTS及还原Fe3+能力三种方法对粗提物进行抗氧化活性的测定,采用滤纸片法测定粗提物金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的抑制活性。结果表明:乙酸乙酯提取的25株胜红蓟内生真菌都具有抗氧化活性,其中菌株WZ07抗氧化活性显著,在粗提物浓度为2 mg/m L时对清除DPPH自由基率可达87.23%,对清除ABTS自由基率为94.72%,与阳性组维生素C清除能力相当,对Fe3+还原力OD值为0.78;乙酸乙酯提取的25株胜红蓟内生真菌有11株真菌显示出了抑菌活性,其中菌株WL01浓度为2 mg/m L时,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为10.23±0.04、10.47±0.11、12.97±0.11 mm,WP04菌株浓度为2 mg/m L时,对铜绿假单胞菌抑菌圈直径为12.29±0.21 mm。该结果为下一步深入研究胜红蓟内生真菌代谢产物提供理论基础。(3)采用真菌培养液与硝酸银溶液反应,对分离得到的25株胜红蓟内生真菌进行初筛,结果发现有10株真菌可以合成AgNPs,其中以WZ07菌株合成能力最好;考察了反应时间、菌株生物量、硝酸银浓度、p H及温度对WZ07菌株合成AgNPs的影响;并采用紫外-可见分光光度计(UV-vis)、动态光散射粒度仪(DLS)、Zeta电位分析仪、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、X射线能谱(EDS)以及热重(TG)以及表征手段对合成条件最佳的AgNPs的形貌、粒径大小、晶型结构、产率等进行了表征;评价了AgNPs的抗氧化、抑菌和催化性能。结果发现:反应时间48 h、生物量5 g、硝酸银浓度5 mmol/L、p H 7.0、温度55℃为菌株WZ07合成AgNPs的最优条件;在最优合成条件下制得的AgNPs主要为球形和伪球形,少数为三角形,粒径尺寸分布范围为8-56 nm,主要分布在32-38 nm范围内,平均粒径为33.8 nm,为面心立方体结构的晶体,主要以(111)晶面为主,通过FTIR分析结果推测提取物中的羟基、酰胺I、II键等官能团参与了AgNPs的还原和稳定过程,热重分析得到AgNPs产率为92.59%,DLS结果显示AgNPs水合粒径为50.28±1.07 nm,多分散指数为0.254±0.015,这表明颗粒单分散性好,Zeta电位为-25.58±0.72 m V,AgNPs表面带负电,具有良好的稳定性;本实验条件下合成的WZ07-AgNPs对DPPH和ABTS自由基有很强的清除作用,当WZ07-AgNPs质量浓度为1 mg/m L时,清除率分别可达98.33%和90.55%;WZ07-AgNPs质量浓度为2 mg/m L时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有很好的抑制作用,抑菌圈直径分别为10.35±0.07、8.83±0.07、10.88±0.1、13.61±0.16 mm;WZ07-AgNPs质量浓度为0.1 mg/m L时对4-硝基苯酚、甲基橙、罗丹明B、亚甲基蓝具有良好的催化活性,其催化反应速率常数k分别为1.01 min-1、1.2 min-1、5.624×10-1min-1、2.165×10-1min-1。该结果为生物合成AgNPs提供更多的真菌资源,对于WZ07-AgNPs的开发和应用奠定了数据基础。(4)考虑到AgNPs在生产和应用过程中会不可避免地排入环境,对环境和生物造成影响,因此本研究以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为受试生物,采用小球藻生长、叶绿素含量、蛋白质含量、生理生化指数等指标比较了WZ07-AgNPs和市场上购买的AgNPs的毒性效应。结果表明:暴露0.1-10mg/m L的WZ07-AgNPs和购买-AgNPs的条件下24、48、72、96h蛋白核小球藻的藻细胞生物量均受到了不同程度的抑制,且呈浓度-效应和时间-效应关系,WZ07-AgNPs和购买-AgNPs对蛋白核小球藻的96h-EC50分别为15.99mg/m L和12.69 mg/m L;暴露96 h后,随着两种AgNPs浓度的增加,蛋白核小球藻细胞叶绿素含量逐渐减少、蛋白质含量呈先增加后减少的趋势,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性降低、MDA含量显著增加,说明藻细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)过量积累,破坏藻细胞的膜结构与功能,使细胞遭受严重损伤;WZ07-AgNPs比购买-AgNPs具有更好的生物相容性。该结果可为WZ07-AgNPs的生态风险评估提供理论数据。
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