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枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),己成功应用于多种植物病害的防治,是生防微生物的重要组成部分。B.subtilis 9407是本实验室从苹果上分离获得的有益芽胞杆菌,对苹果轮纹病具有明显的防治效果,应用前景广阔。本研究利用分析化学和分子生物学技术,探究了该菌株抑制苹果轮纹病菌(Botryosphaeriadothidea)和瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax citrulli)的主要抑菌物质及其在生物防治中的作用、MecA在定殖和细菌性果斑病生物防治中的作用、MecA调控生物膜形成的途径,不仅有利于揭示生防芽胞杆菌的防病机制,而且有助于探寻提高生防菌生防效果的新途径。1.B.subtilis9407抑菌物质fengycin对苹果轮纹病生物防治作用。为深入研究该菌株的主要抑菌物质及生防机制,本研究筛选了 14,300株随机插入突变体,获得34株对B.dothiddea抑菌能力发生显著变化的突变体。通过Southern blot、反向PCR和测序分析确定突变体Q4-33(抑菌能力显著降低)中,转座子插入位点为基因ppsB。本研究构建ppsB缺失突变体△ppsB。抑菌活性测定和高效液相色谱检测结果显示AppsB的抑菌活性显著降低且完全丧失了 fengycin的合成能力。以上结果表明,fengycin是B.subtilis 9407抑制B.dothidea的主要抑菌物质。苹果果实上的生防效果测定结果表明,与B.subtilis 9407相比,△ppsB的生防效果降低约50%,fengycin在防治苹果轮纹病中发挥重要作用。2.B.subtilis 9407抑菌物质surfactin对瓜类细菌性果斑病的生物防治作用。本研究发现B.subtilis 9407对A 具有强烈的拮抗作用,温室条件下对瓜类细菌性果斑病(BFB)的防效达61.7%。为研究该菌株的主要抑菌物质及其在生防中的作用,本研究构建surfactin合成能力丧失的突变体△srfAB。抑菌活性测定结果表明,△srfAB不能抑制A.citrulli生长,surfactin是B.subtilis 9407抑制 A.的主要抑菌物质。定殖能力检测结果显示,△srfAB生物膜形成能力降低,swanning能力丧失,在甜瓜根部和叶部的定殖量下降4-10倍。温室条件下生防活性测定结果显示,△srfAB对BFB无防治效果,surfactin在B.subtilis 9407防治BFB中发挥重要作别。本研究结果表明,surfactin通过抑制病原菌的生长和增强菌株的定殖能力提高B.subtilis 9407的生防效果。3.B.subtilis 9407 MecA对定殖和细菌性果斑病生物防治的作用。研究影响生物膜形成的基因,确定其与定殖相关性及在生物防治中的作用,有助于明确生防菌的生防机制。本研究筛选5,000株随机插入突变体,获得生物膜形成能力发生变化的突变体32株,候选基因17个。其中,mecA插入突变体生物膜形成显著降低,与B.subtilis 168中MecA负调控生物膜形成不同。而且,目前尚无MecA与生防芽胞杆菌定殖相关性的报道。为了探究MecA在B.subtilis 9407定殖和防治BFB中的作用,本研究成功构建了缺失突变体△mecA(pBE2)和互补菌株AmecA(pBE2A)。与 9407(pBE2)相比,AmecA(pBE2)生.物膜形成能力降低,swarming能力丧失,在甜瓜根部和叶部的定殖量下降7-20倍,△mecA(pBE2A)恢复上述表型,MecA促进菌株生物膜形成和swarming.与定殖能力正相关。平板拮抗实验表明,MecA不影响B.subtilis 9407的抑菌活性。温室条件下,与△mecvA(pBE2A)和9407(pBE2)相比,AmecA(pBE2)对BFB无生防效果,表明MecA在B.subtilis 9407防治BFB中发挥重要作用。4.B.subtilis 9407 MecA对生物膜形成调控途径分析。为了探究MecA调控B.subtilis 9407生物膜形成的途径,本研究利用β-半乳糖苷酶活性检测确定MecA正调控eps的转录,负调控tapA-sip W-tasA的转录。通过构建缺失突变体并将sinI、sinR、abrB和spo0A分别互补到△mecA证明上述基因是B.subtilis 9407生物膜形成的关键因子并参与MecA对生物膜形成的调控。在△mecA中,sinI和spo0A的表达下降,sinR的表达增加,abrB的表达下降,生物膜形成能力降低。因此,在B.subtilis 9407中,MecA通过三条途径调控生物膜的形成。首先,MecA促进spo0A的表达,通过SinI/SinR和AbrB途径调控eps和tapA-sip W-tasA的表达;其次,MecA抑制sinR的表达,解除SinR对基质基因表达的抑制而促进生物膜的形成;最后,MecA促进abrB的表达进而影响生物膜形成。