研究背景和目的自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorders,ASD)是一组发病于幼年早期的神经发育障碍疾病,它的核心症状表现为语言、社交功能障碍和刻板样行为,同时可能共病智力障碍、癫痫、焦虑等。自闭症谱系障碍在男孩中的发病率为女孩的4-5倍。双生子研究发现同卵双胞自闭症的发病一致性为47%-96%,而异卵双胞胎为0%-36%。最近的流行病调查研究报道自闭症谱系障碍的发病率在过去15年有显著的升高,现发病率约为1/110,但其患病率的增长原因始终不明[1-6]。对自闭症谱系障碍的神经病理学研究发现,患者幼年早期就存在广泛神经发育缺陷,先天影响因素在其起病过程中起到非常大的作用。遗传学研究发现自闭症谱系障碍有很强的遗传倾向,且与许多基因缺陷的相互作用有关[7]。目前发现的与自闭症相关的基因有二百多个,其中涉及多条通路:突触发育相关基因如neurexins,neuroligins,shanks,reelin,整合素、钙粘素和接触蛋白,虽然这些基因的突变只出现在极少数病例身上[8-16];信号通路、转录通路、甲基化通路和神经营养通路相关基因如张力蛋白同源物(PTEN)、MET、engrailed 2(EN2)、甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)、脆性X智力缺陷1(FMR1)、结节状硬化2(TSC2)、电压依赖L型钙通α1C(CACNA1C)、大电导钙激活钾通道(KCNMA1)、泛素连接酶E3A(UBE3A)、钙离子依赖分泌激活蛋白2(CADPS2)和脑源性神经营养因子(BDNF)等[17-24];神经元突触传递相关基因如5-羟色胺转运体、催产素、血管升压素转运体和GABA受体β3亚基等,这些基因都先后被报道参与到自闭症谱系障碍社交、亲和行为缺陷中[25,26]。虽然遗传学的研究结果为自闭症谱系障碍的发病机制提供了大量的证据和思路,但人们对引起自闭症的分子机制和细胞机制依然知之甚少。2006年一篇临床文献报道了一位自闭症患者身上发生了由于染色体异位导致的10号染色体上KCNMA1基因——编码大电导钙激活钾通道α亚基的基因——的物理性破裂,这个破裂位于KCNMA1基因第一个外显子的启动子中,导致基因编码失功能。对其进行分子和功能性研究发现KCNMA1基因的破裂导致基因单倍量不足并且降低了 BKCa通道的活性[27]。2012年又有报道称自闭症患者中KCNMA1基因存在两处突变,其中一个为错意突变[28]。大电导钙激活钾通道BKCa在大脑中有广泛的分布,在亚细胞结构上主要分布在突触前活动区。这些通道可直接被去极化和升高的钙离子水平激活,激活后它们迅速地帮助神经元超极化并终止从电压门控钙通道进来的钙离子流入,从而发挥调节突触传递和神经元兴奋的作用[29]。由于BKCa通道能对中枢神经系统的兴奋性和突触可塑性进行调节,而BKCa通道的失功能会导致大脑的兴奋性/抑制性不平衡和突触可塑性失调,这又是许多神经精神疾病的发病机制,所以功能失调的BKCa通道有可能参与许多精神疾病的发病或持续过程。BKCa通道的失功能曾多次被报道与精神疾病相关如精神分裂症、抑郁症、焦虑、癫痫、认知失调、运动学习问题等[30-33]。所以自闭症患者身上出现BKCa通道的部分失功能提示部分自闭症可能由于BKCa通道功能失调引起。尽管自闭症谱系障碍的症状已经被深入理解,但到底是患者的哪个脑区出现了损伤导致自闭症的发生发展,人们知之甚少。许多研究发现,自闭症的发生发展可能与前额叶、杏仁核和小脑的结构功能异常有关。但目前并没有清楚明确的、各研究前后一致的病理机制来解释自闭症。在人类身上,小脑的损伤能引起严重的社交功能障碍;由于早产在围产期对小脑造成的损伤能导致社交障碍[34-36];对自闭症谱系障碍患者生前、死后大脑功能、结构研究发现患者在年幼时就出现小脑异常并一直维持到成年。对24个自闭症患者死后大脑研究发现79%的小脑表现出浦肯野细胞密度的减少[37-40]。最近在自闭症相关疾病结节性硬化(Tuberous sclerosis)小鼠模型上的遗传学实验研究发现,在浦肯野细胞上特异性敲除基因TSC1能让小鼠表现出自闭症样行为如社交功能障碍、刻板样行为、固执样行为,这提示仅仅小脑的损伤足以引起自闭症核心症状,说明小脑在自闭症发生过程中起到很重要的作用[41]。另外,关于BKCa通道敲除小鼠的研究发现这些小鼠存在小脑浦肯野细胞功能异常,从而导致小脑功能失调——异常的运动能力、运动学习能力以及严重的运动失调。综合以上的研究证据,我们认为部分自闭症谱系障碍是由于大脑BKCa通道的部分缺失导致的,其机制可能是小脑的BKCa通道的缺失引起浦肯野细胞乃至整个小脑的功能失调,从而引起下游神经网络改变以至行为表现异常。我们的研究将对此假设进行深入探讨。方法1.PCR鉴定BK+/-小鼠剪取小鼠的尾尖放入SNET裂解液在水浴锅中55℃消化过夜。次日将样品离心,吸取上清至另一 EP管后加入等体积的氯仿,上下震荡混匀至卤化,室温静置5分钟后离心(12000rpm)。小心吸取上清至新管(吸取时尽量靠近中间白色沉淀物而不吸到最下层)后,加入等体积的无水乙醇,上下轻轻混合至出现白色絮状物,后静置5分钟,离心(1000rpm),弃管内液体,通风橱中晾干,加入100ul去离子水溶解DNA。DNA产物PCR反应条件为:94℃,2min;(94℃,30s;53℃,40s;72℃,1min)× 30 cycles;72℃,5min;4℃,保存。2.免疫印迹检测小鼠BK蛋白表达水平用乙醚麻醉3-4个月大的小鼠后迅速断头取脑,用RIPA裂解大脑组织后提取组织蛋白。经变形处理的蛋白提取物加入SDS-PAGE胶加样孔内,电泳后取出胶块进行电转到PVDF膜上。转膜完成后,将膜置于封闭液中,后用1:1000稀释的一抗孵育过夜。二抗稀释于5%脱脂奶粉溶液中,室温孵育1小时后倒掉二抗,洗膜,显影。3.行为实验为检测小鼠的自闭症样行为以及其他相关行为,将小鼠行为学实验安排如下:(1)小鼠8周大时进行旷场试验;(2)小鼠8周大时进行理毛实验;(3)小鼠8-10周大时进行社交行为实验(包括三箱子社交行为实验和分区实验);(4)小鼠10周大时进行埋珠实验;(5)小鼠11周大时进行嗅觉适应/不适应实验。4.电生理记录小脑浸浴在冰冻的人工脑脊液上进行切片,人工脑脊液的成分为(mM):125 NaCl,26 NaHCO3,1.25 NaH2PO4,2.5 KCl,1MgCl2,2 CaCl2和25 glucose。在电流钳实验中,电极内液的成分是(mM):150 K-gluconate,3KCl,10 HEPES,0.5EGTA,3 MgATP,0.5 GTP,5 phosphocreatine-Tris2和5 phosphocreatine-Na2,pH值调至7.2。电流钳以及细胞外记录时使用CNQX,AP5,BMI来抑制AMPA受体、NMDA受体和GABAA受体。5.统计学方法应用SPSS13.0软件对数据进行处理。实验数据以平均数±标准误(Mean±SEM)表示,P值<0.05有统计学差异。两处理组均数比较采用两独立样本t检验(two independent sample t-test)。其中,三箱子社交行为实验中,两组小鼠三个房间停留时间、嗅小金属笼的时间比较用两独立样本t检验;旷场试验中两组小鼠在中央停留时间、30分钟内运动总路程比较用两独立样本t检验;埋珠实验中两组小鼠被掩埋珠子数量比较用两独立样本t检验;分区实验中两组小鼠嗅熟悉小鼠、陌生小鼠的时间的比较用两独立样本t检验;理毛行为中两组小鼠理毛时间比较用两独立样本t检验。电生理采用two-way ANOVA,Bonferroni’s post-hoc 分析。结果1.BK+/-小鼠的基因型鉴定与BK蛋白表达情况利用PCR结果鉴定小鼠基因型,免疫印迹结果显示BK+/-小鼠大脑中的BK蛋白表达量比BK+/+小鼠要少。2.BK+/-小鼠表现出自闭样行为在三箱子社交行为实验中,适应阶段对照组小鼠和BK+/-小鼠均没有表现出对左右空箱室的偏好,但当在某一侧箱室的小金属笼中放入一直陌生小鼠后,对照组小鼠明显花更多的时间停留在有陌生小鼠的箱室,而BK+/-小鼠并没有表现出对陌生小鼠的偏好。当放入第二只陌生小鼠在另一侧箱室时,对照组小鼠表现出强烈地社交新异性,然而BK+/-小鼠没有表现出对新旧陌生小鼠的偏好性。通过另一个检测小鼠社交行为的实验——分区实验,检测BK+/-小鼠的社交行为,结果发现当实验鼠对面放入熟悉小鼠或是陌生小鼠时,对照组小鼠表现出强烈的兴趣,所花的交流时间明显高于BK+/-小鼠。用旷场试验(Open field test)检测小鼠的运动能时发现在30分钟的旷场自由活动中,BK+/+小鼠与BK+/-小鼠在运动能力上没有显著差异。进行嗅觉适应/不适应实验(Olfactory habituation/dishabituation test)时发现,在嗅非社会气味时,BK+/-小鼠与 BK+/+小鼠一样表现出对重复出现的气味适应,对新出现的气味不适应的反应,且嗅的时间没有显著性差异,然而在嗅社会性气味时,虽然BK+/-小鼠依然表现出适应/不适应的反应,但与对照组相比嗅社交性气味的时间明显降低。在理毛实验中BK+/-相比对照小鼠花更多的时间进行自理毛活动;而在埋珠实验中BK+/-小鼠比对照小鼠埋掉更少的珠子。另外,通过在旷场试验前五分钟呆在中央区的时间检测小鼠的焦虑情况发现BK+-小鼠比对照小鼠表现出更焦虑的状态。3.BK+/-小鼠的小脑浦肯野细胞兴奋性增加细胞外记录得到了浦肯野细胞本身的兴奋性结果显示BK+/-小鼠的浦肯野细胞发放频率高于野生型小鼠。另外,当细胞内注入电流后,BKca通道部分缺失的浦肯野细胞更容易被兴奋,表现出更多的动作电位。结论1.在BK+/-小鼠大脑中BK蛋白的表达量比BK+/+小鼠显著减少;2.BKCa通道的部分失功能能引起小鼠自闭症样行为;3.BKCa通道的部分失功能导致小脑浦肯野细胞功能失调。