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目的及意义急性风湿热侵犯心脏后遗留的慢性心脏病变最终导致风湿性心脏病(RheumaticHeart Disease，RHD),风湿热是变态反应性疾病，常侵犯心脏引起全心炎，累及心包、心肌及心内膜。风湿热反复发作的损害最严重的是造成心内膜损伤，特别是二尖瓣的心内膜组织。长期反复炎性反应和血流动力学改变产生的机械性损伤和血小板聚积产生的二尖瓣病变主要有瓣膜交界融合，瓣叶纤维化增厚，腱索及/或乳头肌纤维化缩短、融合和瓣叶钙化。心房纤颤是临床上较为普遍的一种心律失常，心房纤颤时可加重风湿性二尖瓣瓣膜狭窄的程度。房颤对心脏瓣膜的破坏主要表现在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)正常结构的破坏是房颤对心脏瓣膜破坏的主要表现，表现为比例失调和排列紊乱的各型胶原，以及沉积增多。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)两者均为影响细胞外基质代谢最关键的酶类。心房纤颤时MMPs、TIMPs平衡失调使心脏瓣膜破坏，I型和III型排列紊乱，胶原沉积增多。MMP-2，MMP-9和TIMP-2是心房纤颤发生后，MMP和TIMP中表达最具有意义的指标。转化生长因子TGF-通过对MMP和TIMP家族成员因细胞类型而异的基因表达调控作用，表现出调节细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重建的生物学效应。本研究分两部分，第一部分对病变二尖瓣标本行常规组织学检查，及HE、Masson染色，观察病变二尖瓣标本病理改变，定量的计算胶原容积分数(CVF)以反映二尖瓣的纤维化程度，明确瓣膜结构重构的表现。对I型和III型胶原进行免疫组化染色，分析两种胶原在二尖瓣纤维化时的不同表现。第二部分意在了解TGF-、MMPs及TIMPs在合并房颤的风湿性二尖瓣狭窄病变组织中的表达状态在对照组及实验组有无显著性差异,进而反映TGF-, MMPs,TIMPs在二尖瓣重构中的重要作用。材料和方法本课题分为组织病理学实验及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验两部分。一、组织病理学实验选在解放军总医院行MVR的风心病二尖瓣狭窄病人39例，其中24例为持续性房颤患者，设为实验组，15例心律正常患者，设为对照组；组织标本应用HE、Masson染色和免疫组化染色行组织学的检查，观察二尖瓣组织的结构变化，采用分析软件对细胞外CVF进行定量测定，对二尖瓣纤维化进行评估，确定其结构重构表现。对I型和III型胶原进行免疫组化染色，分析两种胶原在二尖瓣纤维化时的不同表现。采取免疫组织化学染色(SP法)对实验组和对照组二尖瓣组织中TGF-l、MMP-2、MMP-9、TIMP-2行染色，普通光镜观察后用高清晰度病理图像分析系统采集图像，对MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表达水平行积分光密度(IOD)测定，取平均值为量化指标，对比两组MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表达水平。二、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验采取RT-PCR技术测定两组MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TGF-l的mRNA表达水平，PCR的扩增产物电泳图像测定的目的基因与-actin基因电泳条带的灰度积分，以二者的比值表示目的基因mRNA含量。明确二尖瓣结构重构时TGF-l、MMP-2、MMP-9、TIMP-2表达的改变。实验结果（1）两组标本HE染色均显示瓣膜的纤维组织明显增生，胶原纤维玻璃样变性、明显钙化等。电子显微镜观察示典型的RHD二尖瓣组织胶原纤维增生，并且伴有排列紊乱、断裂。（2）Masson染色发现，与窦性心律组比较，房颤组患者的二尖瓣组织平均细胞外胶原容积分数（CVF）显著增大(P＜0.05)。（3）免疫组织化学染色结果显示二尖瓣组织的I型胶原蛋白的表达增加(P＜0.05)，但是III型胶原蛋白的表达无显著差异。（4）房颤组MMP-2、MMP-9的IOD值高于窦性心律组，TIMP-2的IOD值低于窦性心律组且差异有统计学意义。（5）RT-PCR结果显示房颤组患者二尖瓣的TGF-l、MMP-2，MMP-9的mRNA表达水平均显著高于窦性心律组（t=3.051，P=0.020；t=3.024，P=0.012；t=2.725，P=0.019；)，TIMP-2的mRNA表达水平显著低于窦性心律组(t=-2.310，P=0.018)。（6）超声心动图检测结果分析，房颤组与窦性心律组比较，前者左房内径较后者显著增大，且差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1．风心病二尖瓣狭窄合并房颤组织标本结构细胞外基质均存在明显病理变化，即纤维组织增生，并且伴有排列紊乱、断裂及钙化。2．风心病二尖瓣狭窄合并房颤组织中TGF-l、MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平及蛋白表达水平显著增加，而TIMP-2的mRNA表达水平显著低于窦性心律组，提示MMPs／TIMPs表达上调可能是RHD二尖瓣细胞外基质重构，二尖瓣纤维化及心房纤颤发生发展的重要分子机制，为进一步研究和防止RHD瓣膜基质重构提供了理论依据。