论文部分内容阅读
研究背景和目的胰腺癌(Pancreatic cancer,PCa)是人类致死率最高的恶性肿瘤之一。目前,其病因尚不明确,可能与多种因素相关,例如遗传因素、饮食因素和慢性胰腺炎等。随着生活水平和饮食结构的变化,以及空气和环境的污染,PCa发病率呈现逐年增高的趋势。PCa五年存活率极低,这主要是由于胰腺癌细胞具有顽强的生长力,早期局部传播和转移能力极强,影响了放射和全身化学治疗的效果。临床上,缺乏有效的早期诊断方法,大多数患者明确诊断时常常已是晚期。虽然手术是其治疗的主要方式,但是仅有小部分的PCa患者适合接受切除手术。无法接受手术的PCa患者目前常用的治疗方式是用5-氟尿嘧啶,cisplatin、gemcitabine或联合使用进行放射治疗和化学治疗。虽然这些辅助治疗手段可以一定程度上抑制PCa病人病情的进一步恶化,但它是否能长期延长患者寿命,还有待于深入临床观察予以证实。故当下迫切需要开发新的PCa治疗策略,寻找到新的有效的治疗药物。Hedgehog信号是一条与胚胎发育相关的、相对保守的信号转导通路,其异常活化与包括PCa在内的多种肿瘤发生发展密切相关。活化的Hedgehog通路可以致细胞周期紊乱、细胞凋亡受抑,同时促进增殖,进而引起细胞恶性转变,终致肿瘤发生。垂盆草是景天科景天属多年生草本植物,其提取物(SSBE)是一种重要的药用植物资源,已在临床上用于治疗湿热黄疽、小便不利、痈肿疮疡。同时,研究显示它还具有免疫抑制、抗炎和抗肝脏肿瘤等作用。然而,关于SSBE抗其它肿瘤的作用,尤其在PCa发生发展中的作用尚未见相关文献报道。本研究首先从体外实验角度评价SSBE对胰腺癌细胞系PANC-1增殖和凋亡、细胞周期、迁移能力等细胞行为的影响;再通过体内实验,观察SSBE对PANC-1在裸鼠皮下形成的移植瘤生长的影响;在前面工作的基础上,进一步探讨对PANC-1细胞中Hedgehog信号途径的影响。此外,本研究也分析SSBE中的黄酮类成分,以明确其抗PCa作用并阐明相关分子机制。希望通过这些研究,为PCa的药物靶向治疗提供新的思路,同时也为PCa发生发展机制的研究积累实验依据。方法1.SSBE对PANC-1细胞凋亡和增殖的影响:分别用相差显微镜观察不同浓度的SSBE对PANC-1细胞形态的影响、CCK-8试验检测SSBE对PANC-1细胞存活率及增殖的影响、Annexin V-FITC染色,流式细胞分析仪检测SSBE对PANC-1细胞凋亡的影响;用q RT-PCR及Western Blot法检测与增殖、凋亡相关分子的Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax、c-Myc、p53和survivin等m RNA或蛋白的表达;用免疫荧光法检测c-Myc和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。2.SSBE对PANC-1细胞周期的影响:分别用流式细胞分析仪检测SSBE对PANC-1细胞周期的影响、Western Blot检测p21(Waf1/CIP1)的表达、q RT-PCR检测cyclin D1 m RNA的表达。3.SSBE对PANC-1细胞的上皮-间质转分化(EMT)的影响:细胞免疫荧光染色和q RT-PCR技术检测SSBE对PANC-1细胞E-cadherin和α-SMA的m RNA及蛋白的影响。4.SSBE对PANC-1形成的裸鼠皮下移植瘤生长的影响:培养PANC-1细胞,颈部后侧皮下注射建立裸鼠PCa移植瘤模型,给予SSBE(10和100 mg/kg-1·d),连续灌胃1个月后,观测瘤体的大小(体积)和重量、有无转移,取瘤组织做病理切片、HE染色后观察。5.SSBE对PANC-1中Hedgehog信号的影响:q RT-PCR检测SSBE对PANC-1细胞中Hedgehog通路的信号分子Ptch1、Smo和Gli1的m RNA表达影响;免疫荧光染色检测Ptch1和Smo的蛋白表达。6.SSBE对皮下移植瘤中Hedgehog信号活性的影响:免疫荧光染色检测皮下移植瘤组织中Ptch1和Smo的蛋白表达,q RT-PCR检测Ptch1和Smo的m RNA表达。7.调控Hedgehog信号对SSBE抗PCa作用的影响:用免疫荧光染色检测重组蛋白Sonic hedgehog(Shh)对SSBE作用下PANC-1细胞中的Hedgehog信号分子Ptch1和Gli1,细胞周期调控分子p27(Kip1)以及间质标志物α-SMA蛋白表达的影响。8.高效液相色谱法(HPLC)解析SSBE的各组分:通过比较不同的标准品与SSBE样品在HPLC中相应色谱峰的面积值,计算SSBE各成分的含量。9.槲皮素对PANC-1细胞凋亡和增殖的影响:分别用相差显微镜观察槲皮素对PANC-1细胞形态的影响、CCK-8试验检测SSBE对PANC-1细胞存活率及增殖的影响、免疫荧光染色检测Rac1蛋白的表达和Western Blot检测p53蛋白的表达。10.槲皮素对PANC-1细胞中Hedgehog信号的影响:用免疫荧光染色检测槲皮素对PANC-1细胞中Ptch1、Smo和Gli1的蛋白表达。结果1.SSBE诱导了PANC-1细胞出现凋亡和坏死的形态学改变,增加了中晚期凋亡或坏死的细胞数(P<0.05);SSBE作用后,Caspase-3、Caspase-8和Bax的m RNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),而Bcl-2的m RNA和蛋白表达明显下调(P<0.05)。提示SSBE可通过线粒体途径诱导PANC-1细胞的凋亡。此外,SSBE也抑制抗凋亡蛋白Survivin m RNA的表达(P<0.05)。提示SSBE对PANC-1细胞凋亡的诱导机制也涉及抗凋亡的抑制作用。2.SSBE对PANC-1细胞的增殖具有抑制作用,并呈现一定的浓度依赖性;SSBE下调了c-Myc的m RNA和蛋白水平(P<0.05),增加了p53的m RNA和蛋白水平(P<0.05);此外,SSBE也抑制PCNA的表达(P<0.05)。提示SSBE对PANC-1细胞增殖具有抑制作用。3.SSBE提高PANC-1细胞G2/M期的比例,降低G0/G1期细胞的比例(P<0.05),提示SSBE诱导PANC-1细胞周期阻滞于G2/M期;此外,SSBE明显提高p21蛋白水平(P<0.05),降低cyclin D1 m RNA水平(P<0.05)。提示SSBE对PANC-1细胞周期的阻滞作用可能是通过影响细胞周期调控分子的表达实现的。4.SSBE抑制了PANC-1细胞间质标志物α-SMA的m RNA和蛋白表达(P<0.05),提高了上皮标志物E-cadherin的m RNA和蛋白表达(P<0.05)。提示SSBE抑制PANC-1细胞从上皮向间质转化(EMT)。5.裸鼠颈部皮下注射约500万的PANC-1细胞,1个月后,颈部形成明显的突起;HE染色后观察,显示为瘤组织样结构。提示PCa裸鼠皮下移植瘤模型构建成功。与皮下移植瘤模型组(122.0±14.8 mg)相比,SSBE灌胃组瘤体生长缓慢,10和100 mg/kg-1·d组的移植瘤质量分别为(29.5±6.3)mg和(25.3±4.5)mg,差异均有显著性(P<0.05)。提示SSBE连续给药可明显抑制胰腺皮下移植瘤的生长。6.SSBE促进PANC-1细胞中Ptch1的m RNA和蛋白表达(P<0.05),抑制了Smo的m RNA和蛋白表达的表达(P<0.05);此外,SSBE也下调了Gli1 m RNA的表达(P<0.05)。提示SSBE对PANC-1细胞Hedgehog信号具有抑制作用。7.与正常胰腺组织相比,PANC-1细胞诱导形成的皮下移植瘤组织中Ptch1的表达明显下调(P<0.05),而Smo的表达则明显上调(P<0.05),提示Hedgehog信号在移植瘤中存在异常活化。应用SSBE干预后,Ptch1 m RNA水平上调(P<0.05),而Smo和Gli1的m RNA水平下调(P<0.05)。提示SSBE抑制皮下移植瘤Hedgehog信号活性。8.重组蛋白Sonic hedgehog(Shh)减弱了SSBE对PANC-1细胞中Ptch1的表达诱导(P<0.05)和Smo的表达抑制(P<0.05)。同时,Shh也逆转了SSBE作用下PANC-1细胞周期相关蛋白p27表达增加(P<0.05)和间质标志物α-SMA的表达下降(P<0.05)。提示SSBE的抗PCa作用涉及Hedgehog信号的激活。9.SSBE中主要的黄酮类成分为槲皮素、山萘酚、异鼠李素、木犀草素和异甘草素。其中,槲皮素含量最高(1.272 mg/g),其次是异鼠李素(0.697 mg/g),之后分别为木犀草素(0.556 mg/g)、山萘酚(0.355 mg/g),异甘草素最低(0.028 mg/g)。10.槲皮素诱导PANC-1细胞出现凋亡和坏死的形态学改变,抑制细胞增殖,并呈浓度和时间的依赖性;槲皮素可诱导细胞迁移标志物Rac1表达的下调(P<0.05);但它对p53蛋白水平无明显影响(P>0.05)。提示槲皮素具有抑制胰腺癌细胞增殖和下调其迁移的活性,可能是SSBE抗PCa作用的主要成分。11.槲皮素可下调PANC-1细胞中Smo和Gli1的蛋白水平(P<0.05),上调Ptch1的蛋白水平(P<0.05)。提示槲皮素对胰腺癌细胞中Hedgehog信号具有抑制作用,与SSBE的活性一致。结论1.SSBE具有抗PCa作用,主要包括:(1)调控胰腺癌细胞周期相关蛋白的表达,引起细胞周期的阻滞;(2)抑制胰腺癌细胞增殖,诱导其凋亡;(3)抑制胰腺癌细胞EMT,降低其侵袭能力;(4)抑制皮下移植瘤的生长。2.SSBE能够抑制Hedgehog信号通路的活性,这是SSBE抗PCa作用的机制之一。3.槲皮素可抑制胰腺癌细胞增殖和下调其迁移的活性,从而发挥抗PCa作用;其抗PCa作用机制涉及Hedgehog活性的下降。它可能是SSBE抗PCa作用的主要活性成分。