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运用高密度寡核苷酸芯片建立大鼠胰腺发育不同阶段(胚胎(E)12.5,E15.5,E18.5,新生和成年)的基因表达谱,经过生物信息学数据分析发现许多与胰腺功能相关的基因在E18.5相对高表达,提示胚胎发育后期胰腺功能正趋于完善和成熟,这个时期是形成典型胰腺结构的关键阶段,而胰腺结构是胰腺发挥正常生物学功能的基础。本研究从基因表达谱中筛选出c-met原癌基因在E18.5特异性高表达,旨在初步探讨该基因及其表达产物c-MET蛋白在胰腺发育不同阶段的表达及细胞组织学定位。为进一步揭示c-MET对胰腺发育的调控作用提供试验室数据。
运用RT-PCR技术对大鼠胰腺发育基因芯片中c-met基因检测结果进行验证(芯片所设计探针位于各条基因3’端非编码区),同时针对c-met基因5’端编码区设计引物,用RT-PCR技术检测c-met基因在胰腺发育过程中的表达。两次RT-PCR检测结果显示:(1)引物设计与基因芯片探针设计所用c-met基因区域一致时,RT-PCR表达趋势与基因芯片检测结果相同;(2)引物设计与基因芯片探针设计所用c-met基因区域不一致时:在胰腺胚胎发育时期c-met的表达趋势反向,而在新生后至成年时期表达趋势趋于一致。分别用蛋白免疫印迹及免疫组织化学技术检测c-MET蛋白在大鼠胰腺发育不同阶段(胚胎(E)12.5、E15.5、E18.5、新生后1天、生后14天、生后21天和成年)的表达及细胞组织学定位。结果显示:c-MET在大鼠胰腺发育E18.5天开始出现表达,新生后升高,生后21天最高,表达量较E18.5天升高近50倍,成年表达量下降。同时,c-MET在胰腺发育不同阶段表达不同的蛋白亚型:胚胎及成年期分别表现两个不同的亚型(190KD,170KD);生后14、21天两个亚型都存在。c-MET蛋白在胰腺的细胞组织学定位随着胰腺发育阶段的变化而变化:胚胎期主要定位在胰腺导管上皮细胞;生后14天除胰腺导管上皮细胞外,胰岛也有少量散在阳性细胞;生后21天胰岛中c-MET阳性细胞的表达较胰腺导管上皮细胞多;成年c-MET又定位在胰腺导管上皮细胞及少量胰岛细胞。基于以上实验结果,c-met原癌基因mRNA的不同表达趋势预示该基因存在不同转录本,在胰腺发育不同阶段的出现c-MET蛋白不同亚型的表达,也与该蛋白已报道的两种不同亚型相符。胚胎和成年胰腺分别表达190KD和170KD的两种亚型,此时蛋白定位于胰腺导管上皮细胞。c-MET在新生胰腺显著、特异性高表达,定位于胰岛细胞和导管上皮细胞;生后胰腺结构重塑阶段,c-MET两种蛋白亚型的显著、特异性高表达提示:c-MET有可能是参与胰岛结构重塑、功能发挥的必要因子之一。这一结论对我们进一步研究该蛋白调节胰腺发育、结构重塑的机制,发现临床治疗糖尿病新靶点提供必要的试验室数据。