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实验目的 通过基因免疫的方法研制抗人髓细胞表面分子CD13单克隆抗体。 实验方法 1)RT-PCR克隆人CD13分子酶活性域(第69~480位氨基酸)基因,将此基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/CD13。2)用基因免疫的方法,将重组质粒pcDNA3.1(+)/CD13通过肌肉注射免疫BALB/C小鼠,经两次常规免疫后,经尾静脉注射高表达CD13的髓细胞白血病细胞系HL60进行加强免疫。3)用常规免疫学技术,取基因免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系NS1融合,初步筛选出稳定大量分泌抗人CD13单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4)使用各种高表达或不表达CD13的细胞系、正常人外周血细胞和10例白血病患者骨髓样本,通过间接免疫荧光流式细胞术、荧光显微镜检测以及Western Blot实验,对单抗进一步的鉴定,获得特异性和临床符合率最好的杂交瘤细胞株2E3。5)经免疫球蛋白类别检测试剂盒检测抗人CD13单抗类别。6)对2E3进行小鼠体内扩大培养,将诱生腹水通过羟基磷灰石柱亲和层析制备纯品2E3,并用FITC标记,制备抗人CD13单抗FITC-2E3。7)通过竞争抑制实验,明确2E3与已知常用抗人CD13单抗所识别CD13分子表位的异同。 结果 1)构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/CD13,经测序鉴定完全正确。2)共获得7株大量稳定分泌抗人CD13单克隆抗体的的杂交瘤克隆株。3)抗人CD13单抗类别均为IgM类,κ链。4)获得抗人CD13单抗纯品2E3及荧光标记抗体FITC-2E3,经鉴定可用于FCM(流式细胞术),适用于临床白血病MFC-IM诊断。5)2E3与已知抗CD13单抗Leu-M7、WM15识别CD13分子不同表位。 结论 用基因免疫的方法,成功研制出抗人CD13单克隆抗体,并获得纯品2E3和荧光标记单抗FITC-2E3,不仅可用于MFC-IM检测,并可以进一步对其相关生物