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本研究通过收集及分离来源于国内各地的40株鱼源嗜水气单胞菌,研究嗜水气单胞菌的耐药性、质粒指纹图谱及不同消除剂对质粒的消除效果,同时探讨质粒指纹图谱及质粒大小与耐药性的关系,研究结果如下:
1.40株供试菌中,2株来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所(S12,S13),2株来源于吉林省水产科学研究院(S6,S7),1株来源于江苏省水产技术推广站(AH9052),7株来源于上海海洋大学病原库(W2,J3,H5,E1,Ba,N2,MN1),其余28株菌为本实验室分离、鉴定保存。菌株鉴定均采用biologELX808TM微生物自动分析系统进行鉴定,通过革兰氏染色及氧化酶试验后,将细菌按操作规程在革兰氏阴性菌鉴定微平板(GN2板)上进行加样,30℃培养16-24h后将GN2板放入系统内读取细菌鉴定结果;并通过PCR对菌株16SrDNA进行特异性扩增,能看见在预期的685bp处有目的片段,大小与嗜水气单胞菌标准菌株(ATCC7966)一致,结合菌株的生物学特征、生理生化特征,可初步确认40株供试菌为嗜水气单胞菌。
2.采用美国临床试验室标准化协会(CLSI)推荐的K-B琼脂法和杭州天和微生物试剂有限公司生产的29种药敏纸片进行药敏试验。结果表明,嗜水气单胞菌对常用的氨基糖甙类、四环素类、喹诺酮类抗生素呈现出不同程度的耐药性,在所试的抗生素中,所有的菌株都对4种以上的抗生素产生耐药性,35%的菌株对9种以上抗生素耐药,12.5%的菌株对15种以上的抗生素耐药,最多的耐26种抗生素。所有的菌株都对林可霉素(LIN)耐药,98%的菌株对青霉素(PG)、阿莫西林(AMX)、克林霉素(CLI)耐药,85%的菌株对万古霉素(VAN)耐药,75%的菌株对头孢拉定(RAD)耐药,35%的菌株对甲氧胺嘧啶(TMP)、呋喃唑酮(FUR)耐药,27.5%的菌株对萘啶酸(NAL)耐药,25%的菌株对四环素(TET)、利福平(RFP)耐药,22.5%的菌株对复方新诺明(SMZ)、氯霉素(CHL)耐药,17.5%的菌株对红霉素(ERY)耐药,15%的菌株对强力霉素(DOX)耐药,12.5%的菌株对呋喃妥因(NFT)耐药,10%的菌株对妥布霉素(TOB)、链霉素(STR)、环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NFL)、恩诺沙星(ENR)耐药,7.5%的菌株对庆大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)、氧氟沙星(OFLX)左氧沙星(LEV)耐药,有一株细菌对奈替米星(NTL)耐药,所有菌株均对阿米卡星(AMK)、米诺环素(MIN)、新霉素(NEO)高度敏感。
3.采用碱裂解法提取嗜水气单胞菌质粒,分别将提取的质粒DNA,用限制性内切酶EcoRⅠ及HindⅢ同时酶切,构建其质粒指纹图谱,并采用Quantityone软件计算酶切后的DNA片段。在所研究的40株嗜水气单胞菌中,结果发现有15株耐药菌携带质粒,质粒的检出率为37.5%。试验发现一般来源相同且耐药类型相似的菌株,质粒图谱及酶切图谱基本相同;对于携带质粒的菌株,耐药谱的宽窄与携带质粒的大小及数量无明显的对应关系;条带大小以5.67kb、2.01kb、1.59kb、1.41kb为主,所占比例分别为80%、73.3%、33.3%、33.3%。
4.15株携带质粒的耐药菌株经EB处理48h后,进行质粒DNA检测、酶切及药敏试验,检测发现所有菌株质粒条带部分消除,质粒消除率为100%,质粒指纹图谱发生了明显的变化。其中菌株S29、N2、H5质粒发生消除现象,但耐药表型未发生变化;另有12株细菌部分耐药表型消失,提示质粒和染色体分别编码耐药基因;未经消除剂处理的菌株质粒指纹图谱未发生变化。采用EB处理的菌株耐药表型主要表现在萘啶酸、呋喃唑酮、林可霉素、万古霉素、红霉素、阿奇霉素的抗性消失及对利福平、万古霉素药物敏感性的增强。耐药性质粒消除试验结果表明,同一质粒消除剂对不同嗜水气单胞菌具有不同的消除效果;其中萘啶酸、万古霉素的耐药性主要由大小为2.01kb的质粒DNA条带介导,但并不是所有含2.01kb质粒条带的菌株都携带这种耐药性。