【摘 要】
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目的:观察不同乙醇浓度对H4-ⅡE细胞增殖抑制、随乙醇浓度变化的内质网应激相关蛋白含量变化、钙离子浓度变化以及细胞凋亡的影响,探讨乙醇对肝损伤的机制。方法:1.采用MTT法检测去使用不同浓度的乙醇进行处理后的大鼠H4-ⅡE细胞的生存率,分别用不同浓度乙醇刺激12h,24h和48h后,测定不同乙醇浓度和持续时间对H4-ⅡE细胞增殖的抑制作用,分为对照组和实验组（0.05mol/L、0.1mol/L、
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目的:观察不同乙醇浓度对H4-ⅡE细胞增殖抑制、随乙醇浓度变化的内质网应激相关蛋白含量变化、钙离子浓度变化以及细胞凋亡的影响,探讨乙醇对肝损伤的机制。方法:1.采用MTT法检测去使用不同浓度的乙醇进行处理后的大鼠H4-ⅡE细胞的生存率,分别用不同浓度乙醇刺激12h,24h和48h后,测定不同乙醇浓度和持续时间对H4-ⅡE细胞增殖的抑制作用,分为对照组和实验组（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L）;2.Fluo-3AM方法检测不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）刺激12小时后的大鼠H4-ⅡE细胞内钙离子浓度的变化;3.蛋白免疫印迹试验法检测在不同浓度乙醇作用于H4-ⅡE细胞12h后,Caspase-3、Caspase-7、Caspaase-12的表达情况;4.流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验结果采用SPSS分析后,以均数±标准差的形式表示,各组间通过单因素多水平的方差分析,P<0.05时,我们认为差异具有统计学意义。结果:1.采用MTT法检测乙醇对H4-ⅡE细胞生存率的抑制作用不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）分别作用12h、24h、48h后,与对照组相比,细胞增殖明显受抑制,说明乙醇可抑制H4-ⅡE细胞的增殖,且与乙醇浓度和刺激时间呈正相关（P<0.05）。2.Fluo-3AM法检测H4-ⅡE细胞经不同浓度乙醇刺激后细胞内钙离子变化在不同乙醇浓度（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）处理12h后的H4-ⅡE细胞中检测细胞内Ca2+浓度,结果显示:随着乙醇浓度增加,细胞内的钙离子浓度随之增高,各组与对照组之间的差异性分析可知,0.2mol/L组与对照组有统计学意义（P<0.05）。3.观察不同乙醇浓度作用12h后的细胞内的Casapase-3、Caspase-7、Caspase-12蛋白表达情况提取不同浓度乙醇（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）干预12h后的H4-ⅡE细胞内蛋白,经蛋白定量分析后,用蛋白免疫印迹试验法检测各组样品中Caspase-3、Caspase-7、Caspase-12的蛋白表达情况,结果显示:经不同浓度乙醇处理的Caspase-3蛋白表达情况随着乙醇浓度增加而增多,对照组与其它各组间差异均有统计学意义（P<0.05）;经不同浓度乙醇处理的Caspase-7的的蛋白表达情况随着乙醇浓度增加而增多,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）;经不同浓度乙醇处理的Caspase-12的蛋白表达情况随乙醇浓度增加而增多,与对照组相比,0.1mol/L、0.2mol/L组蛋白表达增加,结果有统计学意义（P<0.05）。4.流式细胞术观察细胞凋亡率实验组与对照组（0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L）相比明显减少,P<0.05,即早期凋亡、晚期凋亡及死亡细胞比例增多。也就是说细胞凋亡率随乙醇浓度的变化而变化,且呈正相关。结论:1.乙醇对大鼠肝细胞生长具有抑制作用,导致肝细胞内钙离子稳态失衡,发生内质网应激,且这与乙醇浓度和乙醇的持续作用时间有关;2.乙醇诱导细胞内质网应激及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-12的异常表达,导致细胞凋亡并引起肝细胞损伤;3.乙醇所致肝细胞损伤,与钙离子稳态失衡引起内质网应激有关,由此表明可通过调控细胞内钙离子浓度,治疗及预防酒精性肝损伤。
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