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研究背景:轻度认知功能损害（Mild cognitive impairment,MCI）是脑退化到阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease,AD）的中间过渡状态,在65岁及以上成年人的患病率为10%至20%,且风险随年龄增长而增加[1]。MCI表现包括生活质量低下,抑郁症状加重,以及回避社交活动[2]。对患者及社会,都造成了不小的负担。早期难以对MCI进行有效诊断是普筛无法推广的重要因素[3]。炎症和免疫机制被证实与MCI发病机制相关,且炎症标记物可能反映中枢神经系统的变化[4]。目前MCI主流治疗多以认知能力治疗、运动治疗等方式为主[5],然而收效甚微。从菌群-肠-脑轴观点来看,认知损伤与肠道菌群存在关联。与健康人群组相比,MCI组被发现拥有更高的变形杆菌相对丰度[6]。MCI患者中,睡眠受损和昼夜节律紊乱是常见症状,昼夜节律对肠道菌群及其代谢产物至关重要,昼夜节律紊乱使肠道菌群失调[7]。丁酸,作为肠道常见的菌群代谢物,是人肠道上皮细胞的主要营养物质,使结肠细胞保持稳定从而防止癌变。在脑认知方面,丁酸处理β淀粉样蛋白诱导的神经胶质细胞,可抑制NF-κB p65的磷酸化[8]。本课题组前期研究工作显示,单纯给予高盐饮食16周,引起正常小鼠认知损伤,通过细胞自噬影响肠屏障的表达。细胞自噬与常见信号通路PI3K-AKT联系紧密。因此,本研究提出“肠道菌群及其代谢物丁酸通过PI3K-AKT通路改善高盐小鼠认知功能损伤的研究”的假设,以高盐认知损伤小鼠为实验模型,探索菌群及菌群代谢物丁酸对高盐认知损伤的影响以及PI3K-AKT通路可能的潜在作用。为认知损伤治疗靶点药物的研发和临床认知损伤患者的治疗提供新的思路和见解。研究方法:（1）用Y迷宫实验、新异物体识别实验验证HSD（高盐组）和NSD（正常盐饮食组）之间的认知功能表型差异,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法分析两组小鼠海马组织突触素（Synaptophysin,SYP）、突触蛋白1（synapsin 1,SYN1）的m RNA相对表达水平,采用Western blot分析两组小鼠海马组织的SYP、SYN1的蛋白表达水平,分析两组突触功能状态从而评估认知损伤差异。（2）通过HE染色观察不同组小鼠肠道组织形态学变化,使用16S r DNA测序技术分析各组间小鼠肠道菌群组成差异。采用气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）分析各组间小鼠菌群代谢产物丁酸含量差异。（3）通过粪菌移植实验分析肠道菌群在菌群-肠-脑轴中的作用:分析r HSD组（接受高盐饮食小鼠粪菌移植的正常饮食小鼠组）和r NSD组（接受正常饮食小鼠粪菌移植的正常饮食小鼠组）两组间的Y迷宫实验和新异物体识别实验行为学表型差异、海马组织SYP、SYN1蛋白表达水平差异和m RNA水平差异。对两组脑组织进行全长转录组测序分析,找出其中有差异的基因和相关通路,并用Western blot实验对各组别小鼠海马蛋白进行通路验证。（4）验证高盐认知损伤小鼠代表性差异肠道菌和菌群代谢物丁酸与小鼠认知功能的关系。分析丁酸盐干预组（HSD+BA）和对照组之间的行为学表型（Y迷宫和新异物体识别实验）和脑组织SYP、SYN1 m RNA和蛋白表达水平差异。分析差异菌灌胃组和对照组之间的行为学表型（Y迷宫和新异物体识别实验）和脑组织SYP、SYN1 m RNA和蛋白表达水平差异。（5）通过ELISA检测差异菌干预组小鼠和丁酸盐干预组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平。研究结果:1.行为学实验:与NSD组小鼠（正常饮食组小鼠）相比,HSD组小鼠（高盐饮食组小鼠）Y迷宫自发性交替反应率下降（P＜0.01）、新异物体识别实验探索时间率下降（P＜0.001）。与r NSD(接受正常小鼠粪菌移植组相比,r HSD组（接受高盐饮食小鼠粪菌移植组）小鼠Y迷宫自发性交替反应率下降（P＜0.01）,新异物体识别实验探索时间率下降（P＜0.05）。与HSD组小鼠（高盐饮食组小鼠）相比,HSD+BA组小鼠（丁酸盐干预组小鼠）Y迷宫自发性交替反应率上升（P＜0.05）,新异物体识别实验探索时间率上升（P＜0.0001）。与C.lep con组小鼠（柔嫩梭菌对照组小鼠）相比,C.lep组小鼠（柔嫩梭菌干预组小鼠）Y迷宫自发性交替反应率上升（P＜0.01）、新异物体识别实验探索时间率上升（P＜0.001）。2.WB结果:○1突触相关蛋白SYP、SYN1:与NSD组小鼠相比,HSD组小鼠SYP相对表达下降（P＜0.05）,SYN1相对表达下降。与r NSD组相比,r HSD组小鼠SYP相对表达下降（P＜0.05）,SYN1相对表达下降。与HSD组小鼠相比,HSD+BA组小鼠SYP相对表达增加（P＜0.05）,SYN1相对表达增加（P＜0.05）。与C.lep con组小鼠相比,C.lep组小鼠SYP相对表达增加,SYN1相对表达增加。○2脑组织PI3K-AKT通路改变:与NSD组小鼠相比,HSD组小鼠P-PI3K相对表达增加（P＜0.01）、P-AKT相对表达增加。与r NSD组相比,r HSD组小鼠P-PI3K相对表达增加、P-AKT相对表达增加（P＜0.01）。与HSD组小鼠相比,HSD+BA组小鼠P-PI3K相对表达减少（P＜0.05）、P-AKT相对表达减少（P＜0.05）。与C.lep con组小鼠相比,C.lep组小鼠P-PI3K相对表达减少、P-AKT相对表达减少。3.RT-PCR结果:与NSD组小鼠相比,HSD组小鼠SYP基因相对表达量下降（P＜0.001）,SYN1基因相对表达量下降（P＜0.05）。与r NSD组相比,r HSD组小鼠SYP基因相对表达量下降（P＜0.05）,SYN1基因相对表达量下降（P＜0.05）。与HSD组小鼠相比,HSD+BA组小鼠SYP基因相对表达量上升,SYN1基因相对表达量上升。与C.lep con组小鼠相比,C.lep组小鼠SYP基因相对表达量上升（P＜0.01）,SYN1基因相对表达量上升。4.菌群分析结果:与NSD组相比,HSD组在门水平和纲水平出现了改变,增加了变形杆菌门、疣微菌门、厚壁菌门的丰度,种水平上柔嫩梭菌丰度减少。与r NSD组相比,r HSD组在门水平、纲水平、属水平出现改变。与HSD组相比,HSD+BA组在门水平、纲水平、属水平出现改变。与C.lep con组相比,C.lep组在门水平、纲水平、属水平出现改变,菌群构成与HSD+BA组类似。5.短链脂肪酸分析结果:与NSD组相比,HSD组小鼠粪便中丁酸含量减少。与r NSD组相比,r HSD组小鼠粪便中丁酸含量下降。与HSD组相比,HSD+BA组小鼠粪便中丁酸含量上升。与C.lep con组相比,C.lep组小鼠粪便中丁酸含量上升。6.HE结直肠染色结果:与NSD组小鼠相比,HSD组小鼠结直肠出现损伤,正常肠屏障结构发生改变。与r NSD组相比,r HSD组结直肠出现损伤,正常肠屏障结构发生改变。与HSD组小鼠相比,HSD+BA组小鼠结直肠损伤程度较轻。与C.lep con组相比,C.lep组结直肠损伤程度较轻。7.血清炎症因子结果:与HSD组小鼠相比,HSD+BA组小鼠血清中IL-1β含量上升（P＜0.05）、IL-6含量下降、TNF-α含量下降（P＜0.05）。与C.lep con组相比,C.lep组血清中IL-1β含量下降（P＜0.05）、IL-6含量下降（P＜0.01）、TNF-α含量下降（P＜0.01）。研究结论:1.高盐饮食小鼠中柔嫩梭菌相对丰度及其代谢物丁酸盐含量下降。2.移植高盐饮食小鼠粪便使正常小鼠认知功能和肠屏障出现变化,菌群相对丰度改变,丁酸含量改变,脑转录组PI3K-AKT通路发生变化。3.柔嫩梭菌及其代谢物丁酸的干预改变了高盐饮食小鼠的认知功能、肠道功能及血清炎症因子水平。4.柔嫩梭菌及其代谢物丁酸的干预改变了高盐饮食小鼠PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达。