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在轴突信息传递过程中,髓鞘可将神经冲动迅速而准确地向下传导,并包绕在神经细胞轴突外,起绝缘、支持和保护等作用。由于社会老龄化,与年龄相关的神经退行性疾病的发病率也逐年上升,越来越多的研究发现,在阿尔茨海默症、帕金森、亨廷顿舞蹈症、多发性硬化、多系统萎缩等神经退行性疾病中,髓鞘均表现不同程度损伤,提示髓鞘损伤是该类疾病发生发展的重要因素。当机体发生髓鞘损伤时,如何促进髓鞘的再生和修复是治疗这类神经退行性相关疾病的关键策略之一。然而,少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)作为中枢神经系统中唯一可形成髓鞘的细胞,其本身不具备细胞分裂、增殖能力,它的增殖依赖于少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的增殖和分化成熟。由此可见,OPCs增殖和分化是治疗这类神经退行性相关疾病的关键。在我们的前期实验研究中发现,星形胶质细胞(Astrocytes,ASTs)通过与OPCs直接接触的培养方式能够促进OPCs的增殖,但其机制尚不清楚。本实验中通过建立ASTs和OPCs直接接触式共培养、OPCs与ASTs分泌的上清液共培养以及OPCs单独培养三种模型,并对OPCs进行一系列干预,发现ASTs通过Cx47与OPCs建立起信息传递通道,ASTs将增殖信息传递到OPCs后,刺激OPCs的Chi3l1基因表达增加,Chi3l1分泌出胞后又以自分泌或旁分泌的形式作用于自身或者邻近的OPCs细胞表面的Myh9,使OPCs的Cyclin D1表达上调,Cyclin D1作为一种调节细胞周期的蛋白,它可以推动细胞从G1期向S期过渡,从而调控OPCs的细胞周期,促进OPCs的增殖。通过本研究可以为神经退行性疾病提供新的治疗靶点和理论基础。本研究分为三个部分:第一部分:ASTs通过Cx47与OPCs建立信息传递促进OPCs增殖本部分通过构建OPCs三种不同的体外培养模型,利用倒置相差显微镜、流式细胞术和EdU检测细胞增殖能力;对上述培养方式收集的OPCs进行二代测序分析差异表达的基因,利用GO功能富集分析二代测序的结果,筛选出差异基因Cx47;在直接接触式共培养条件下siRNA干扰Cx47的表达后,利用流式细胞术和EdU检测OPCs的增殖能力。主要结果如下:1、对OPCs单独培养,OPCs与ASTs的上清培养,OPCs与ASTs直接接触式共培养的条件下OPCs的增殖能力检测,倒置相差显微镜、流式细胞术和EdU结果显示,直接接触式培养的OPCs处于S期细胞比例相较于上清共培养和单独培养条件下的OPCs显著增加(p<0.01),且新生细胞的比例也明显增加(p<0.01)。2、收集上述三组培养条件下的OPCs进行二代测序分析表达差异基因,对GO功能注释到通道活性的差异表达基因进行热度分析,筛选和鉴定出Cx47。3、OPCs与ASTs直接接触式培养条件下对Cx47进行siRNA干扰,利用Western blot和免疫荧光检测到Cx47表达量降低明显(p<0.01),流式细胞术和EdU检测结果显示OPCs的细胞增殖能力随Cx47的表达量降低而降低。以上结果证明ASTs通过与OPCs直接接触诱导OPCs的Cx47表达促进OPCs的增殖。第二部分:ASTs通过OPCs的Cx47刺激Chi3l1分泌促进OPCs增殖本部分对第一部分实验中二代测序结果的表达差异基因进行进一步GO功能分析,并对富集到细胞外分泌的差异基因进行火山图分析,筛选出差异表达基因Chi3l1;在接触式共培养条件下干扰Cx47后,Western blot和免疫荧光检测OPCs的Chi3l1表达量;在单独OPCs培养条件下,加入外源Chi3l1后,流式细胞术和EdU对OPCs的增殖能力进行检测,Western blot检测Cyclin D1的表达情况。主要结果如下:1、GO分析和火山图筛选出Chi3l1在不同培养条件下的OPCs中表达差异显著。2、siRNA干扰Cx47后,Western blot结果显示Chi3l1的条带灰度值明显降低(p<0.01),免疫荧光结果显示Chi3l1的荧光强度在siRNA特异性干扰Cx47后明显减弱(p<0.01)。3、在单独培养OPCs条件下加入外源性Chi3l1,流式细胞术显示OPCs细胞进入S期的比例增加(p<0.05),且EdU结果显示新生细胞的比例增加(p<0.01)。4、在单独培养OPCs条件下加入Chi3l1,Western blot结果显示Cyclin D1的表达量增加(p<0.01)。以上结果说明,ASTs可以通过上调OPCs的Cx47的表达进而刺激Chi3l1的分泌促进OPCs的增殖。第三部分:Chi3l1通过与OPCs的Myh9结合调节Cyclin D1的表达本部分实验利用Chi3l1的抗体与琼脂糖珠和OPCs的蛋白匀浆混匀后进行Pull-down实验,将下拉蛋白进行凝胶电泳和考马斯亮蓝染色,将染色后的条带进行质谱分析,得到Myh9蛋白。之后对Myh9加以验证,利用Myh9抗体与琼脂糖珠和OPCs的蛋白匀浆进行Co-IP实验,将下拉蛋白进行Western blot检测Chi3l1的存在与否。在加入外源性Chi3l1条件下的OPCs对Myh9进行siRNA干扰,Western blot检测Myh9以及Cyclin D1的表达,免疫荧光检测Myh9的荧光强度,流式细胞术和EdU检测OPCs的增殖能力。主要结果如下:1、质谱分析结果显示Pull-down下拉的蛋白条带中含有Myh9蛋白。2、Co-IP实验中,同样蛋白浓度下,Myh9抗体组与山羊IgG组相比,Chi3l1的蛋白条带灰度显著加深,印证了Myh9可以与Chi3l1相结合。3、siRNA干扰Myh9后Western blot和免疫荧光结果显示Myh9的表达量降低(p<0.01);流式细胞术结果显示OPCs进入S期的比例随着Myh9的干扰而降低(p<0.01),与EdU检测细胞增殖能力的结果相一致(p<0.01);同时,在siRNA干扰Myh9后,Western blot检测到Cyclin D1的表达量降低(p<0.05)。以上结果说明Chi3l1可以与OPCs表面的Myh9结合激活Cyclin D1的表达,促进OPCs的增殖。