链霉素特异性单链DNA适配体的筛选及其在检测中的应用

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链霉素是一种从灰色链霉菌培养液中提取的氨基糖苷类抗生素,它是目前使用较广泛的一种抗菌药。当链霉素过量使用时,会造成其在动物源性食品中残留,对人类健康造成危害。因此,建立高效、准确、经济的链霉素残留检测方法对食品安全具有十分重要的意义。论文通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从初始寡核苷酸文库中筛选与链霉素具有高亲和力高特异性的单链DNA(ssDNA)适配体(aptamer)。选用中间含35个随机核苷酸序列,全长79个核苷酸的ssDNA作为筛选的起始文库,采用链霉素修饰的环氧基磁珠作为筛选适配体的亲和介质,利用链霉素与适配体的特异性结合对ssDNA文库进行筛选。将初级ssDNA文库90℃变性10min后加入到链霉素修饰的环氧基磁珠中,室温反应30min,将未结合到磁珠上的ssDNA冲洗干净。用洗脱缓冲液在80℃条件下将结合到链霉素修饰磁珠上的ssDNA洗脱下来。将洗脱得到的ssDNA纯化后进行PCR扩增,PCR反应的条件为:95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,20个循环。筛选共重复进行8轮,每2轮进行一次反筛选除去与磁珠本身及表面乙醇胺基团具有亲和力的ssDNA。用ELISA法对每轮筛选获得的适配体与链霉素的亲和力进行评估,发现经过8轮SELEX筛选得到的ssDNA与链霉素的亲和力不再升高,经过克隆、测序获得了16个能与链霉素特异性结合的ssDNA适配体序列。最后通过平衡渗透法对序列的解离常数Kd进行测定,确定适配体STR1序列的Kd值为199.1nM,说明其与链霉素具有很高的亲和力。利用筛选得到的适配体STR1,建立基于金纳米颗粒(AuNPs)的比色分析法对链霉素进行检测。ssDNA适配体能够吸附到AuNPs表面,增加AuNPs在NaCl溶液中的稳定性。当链霉素存在时,它能够特异性地结合吸附在AuNPs表面的ssDNA适配体,从而降低了AuNPs在NaCl溶液中的稳定性,引起AuNPs聚集,使溶液颜色由红色变成紫色。通过紫外-可见光谱扫描法对链霉素进行定量分析,可检测到链霉素浓度的线性范围为0.2~1.2μM。而当其它氨基糖苷类抗生素加入到吸附ssDNA适配体的AuNPs溶液时,并不影响AuNPs的稳定性,这种实验结果表明该方法检测链霉素具有较高的特异性。运用建立的该种检测方法,进一步对人工污染的多种蜂蜜样品中的链霉素进行检测。当蜂蜜稀释液中链霉素浓度在0.2~1.2μM范围时,AuNPs在520nm处的吸光值与链霉素浓度呈良好的线性关系,检测结果跟链霉素标准品一致,证明该方法在实际样品检测中可以良好应用。
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