豆科植物可与根瘤菌形成共生关系,植物为根瘤菌提供碳水化合物及适合其生存代谢的环境以换取根瘤菌从大气氮转化的氨态氮,自然界中有近四分之三的氮源来自该类共生固氮体系,根瘤菌-豆科植物共生固氮亦是固氮效率最高的生物固氮体系。宿主植物与根瘤菌之间的一系列生物分子信号识别、传递和转换介导形成了高效固氮的共生体系。在此过程中苜蓿中华根瘤菌的Lys R家族蛋白扮演着十分重要的角色,课题组前期从该家族的突变体库中筛选到一个共生必需的蛋白LsrB,lsr B缺失突变体对氧化剂更加敏感,其诱导无法形成正常的有效固氮根瘤,而且发育异常的根瘤内有大量的过氧化氢积累。LsrB的底物结合结构域中三个半胱氨酸位点突变表型类似。我们初步推断LsrB是一种依赖半胱氨酸活性催化位点的新型氧化还原蛋白,为了进一步探究其感受氧化信号的分子机制,我们针对LsrB结构域功能及半胱氨酸位点功能做了进一步的研究。通过对实验室前期构建的LsrB DNA结合结构域缺失突变体△lsr B₁₁₆和底物结合结构域缺失突变体△lsr B₁₈₇通过q-RTPCR检测氧化信号相关基因的表达量,我们发现△lsr B₁₈₇中过氧化氢酶编码基因kat A的表达量升高,而△lsr B₁₁₆中kat A的诱导表达亦有显著升高,但升高的幅度远不及△lsr B₁₈₇。在蛋白表达水平上,我们通过native-PAGE胶染色的方法检测了Kat A的蛋白水平,发现△lsr B₁₁₆中Kat A的活性略高于野生型,但低于△lsr B₁₈₇和△lsr B,结合实验室前期发现的△lsr B₁₈₇对氧化剂GSSG更加敏感的表型,以上结果表明,LsrB底物结合结构域缺失突变体△lsr B₁₈₇的氧化应激反应更为强烈。通过液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）分析每个突变体的氧化型/还原型谷胱甘肽的水平,发现△lsr B₁₁₆中GSH/GSSG的比例更接近于野生型,而△lsr B₁₈₇中的GSH/GSSG比例与△lsr B近似,我们的研究结果显示LsrB底物结合结构域控制着根瘤菌的氧还状态。为了进一步探究LsrB蛋白底物结合结构域上每个半胱氨酸残基位点的功能,我们将构建好的各个位点点突变的底物结合结构域片段表达载体转入lsr B缺失突变体中表达,我们发现各Cys位点突变均会导致共生有效固氮结瘤数量和生物固氮量显著下降,而Cys146位点的突变更是严重影响类菌体的共生固氮效率,说明Cys146位点很可能是一个具有抗氧化功能的位点。课题组前期的基因组DNA分析显示LsrB的同源蛋白高度保守且几乎存在于所有的根瘤菌中,我们克隆了含有Cys172和Cys238位点的大豆根瘤菌、仅含有Cys146位点的百脉根根瘤菌以及不含任何Cys残基的田茎根瘤菌这三种根瘤菌的lsr B同源基因,通过表达载体转入lsr B缺失突变体中表达分析Cys146功能。氧化剂敏感性分析表明,表达含有Cys残基的Plsr B_bj和plsr B_ml都能互补lsr B缺失突变体的抗氧化缺陷,而plsr B_ac不能,且plsr B_ac不具有任何Cys位点,说明残基Cys146或Cys172是细菌LsrB同源蛋白中ROS解毒的必要位点。共生表型分析表明,表达LsrB_ac^V146C和LsrB_ac^A172C的菌株完全抑制了lsr B缺失突变体的共生缺陷,但LsrB_ac^V231C和LsrB_ac^T269C却没有,结果充分说明了LsrB及其同源蛋白的底物结合结构域中的Cys146和Cys172是ROS解毒的关键位点。课题组前期工作中的转录组测序结果及CHIP-Seq结果均提示LsrB有可能直接调节自身基因的表达,为验证这一猜想我们在体外纯化了LsrB蛋白,应用带有生物素标记的lsr B启动子片段通过电泳迁移率实验（EMSA）证实了他们可以直接结合,竞争实验表明该结合是特异的。基于我们之前的研究中发现LsrB的半胱氨酸残基Cys238对lsr B下游基因表达至关重要,参照前人对Oxy R转录调控模式的分析方法,我们想探究LsrB与自身启动子的互作是否依赖这些Cys残基。我们纯化了各半胱氨酸位点替换为丝氨酸的LsrB突变蛋白,通过凝胶阻滞实验证明LsrB-DNA复合物的形成依赖Cys238,且任何条件下都不需要Cys146参与。为进一步确定lsr B基因启动子上的LsrB蛋白结合位点,我们合成了FAM荧光标记的lsr B上游启动子片段,通过免疫足迹实验（Dnase I Footprinting Assay）鉴定到了与LsrB蛋白结合的启动子序列片段。结果证明了lsr B基因的表达通过其编码蛋白直接与启动子上顺式作用元件相互作用进行自调节。我们注意到根瘤菌LsrB同源蛋白中半胱氨酸残基的位点数量与其宿主的生长环境有着非常有趣的相关性。我们模拟了水生和陆地土壤条件种植苜蓿幼苗,通过NBT染色和根瘤菌附着实验发现:与水生条件相比,陆地土壤条件下生长的苜蓿主根近根尖侧和根毛区积累的ROS水平更高,而水生环境下生长的苜蓿根上定殖的根瘤菌更多。说明根瘤菌LsrB的Cys146和Cys172残基的进化与豆科植物宿主在不同生长环境下的氧化胁迫有关。LsrB作为一种氧还蛋白其还原途径仍未知,参照硫氧还蛋白Trx和谷氧还蛋白Grx二硫键生成-断裂的氧化还原模式,我们利用免疫沉淀技术来检测LsrB蛋白与Grx和Trx的互作。实验结果表明,LsrB与Grx、Trx在体内均可发生相互作用,保留一个Cys残基的苜蓿中华根瘤菌的LsrB可以与Grx C蛋白互作,但是这种互作缺少Cys残基特异性,LsrB蛋白可以在胞内与Trx A互作,而且这种相互作用需要LsrB至少含有2个Cys残基。综上所述,LsrB是苜蓿中华根瘤菌Lys R转录因子家族中进化出的一种新型氧还蛋白,lsr B基因的表达是通过其编码蛋白直接与启动子上保守的顺式作用元件相互作用从而实现自调节。LsrB蛋白应对氧化胁迫的ROS解毒功能依赖底物结合结构域中的Cys146残基,该位点的进化可能与豆科植物根系在不同生长环境下的氧化胁迫有关。氧化状态下的LsrB蛋白可能被硫氧还蛋白Trx还原。