【摘 要】
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昆虫病原真菌是一类重要的生防资源,具有不易使寄主产生抗性、对环境友好以及良好的扩散效果等优点,应用潜力巨大;然而也存在受环境影响大、杀虫速度慢及生产成本高等缺点,限制了其大规模使用。因此,相关基础研究的强化,对于杀虫真菌农药的生产和应用具有重要推动作用。Gti1/Pac2家族蛋白是真菌中普遍存在的重要转录因子,对调控真菌生长及致病等过程起重要作用。本研究以模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌（Metarhiz
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昆虫病原真菌是一类重要的生防资源,具有不易使寄主产生抗性、对环境友好以及良好的扩散效果等优点,应用潜力巨大;然而也存在受环境影响大、杀虫速度慢及生产成本高等缺点,限制了其大规模使用。因此,相关基础研究的强化,对于杀虫真菌农药的生产和应用具有重要推动作用。Gti1/Pac2家族蛋白是真菌中普遍存在的重要转录因子,对调控真菌生长及致病等过程起重要作用。本研究以模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）为研究材料,克隆了其中的两个Gti1/Pac2家族蛋白基因MaGti1和MaPac2,并采用基因敲除和回复策略研究了这两个基因在蝗绿僵菌生长、抗逆和致病过程中的作用。本文所取得主要结果如下:1.蝗绿僵菌中Gti1/Pac2家族蛋白的生物信息学分析对蝗绿僵菌的全基因组序列进行分析发现,蝗绿僵菌中的Gti1/Pac2家族蛋白含有两个成员MaGti1和MaPac2,它们的c DNA全长分别是1482 bp和1269 bp,分别编码493和422个氨基酸,均具有一个典型的Gti1/Pac2家族结构域（Pfam09729）。2.敲除MaGti1或MaPac2影响蝗绿僵菌生长。为了明确MaGti1和MaPac2的功能,我们分别成功构建了这两个基因的敲除菌株和回复菌株,并对各菌株在1/4 SDAY培养基上的萌发率及产孢量进行测定,分析结果发现,敲除MaGti1和MaPac2均促进了孢子的萌发,另外,MaGti1ΔDOCK（功能结构域缺失）、MaGti1S75A（CDK磷酸化位点丝氨酸突变为丙氨酸）和MaGti1T69A（PKA磷酸化位点苏氨酸突变为丙氨酸）的孢子萌发速率同样显著加快。与野生型菌株相比,ΔMaPac2的产孢量显著下降,ΔMaGti1的产孢量无显著变化。3.敲除MaGti1或MaPac2影响蝗绿僵菌抗逆能力。在对各菌株孢子分别进行湿热、紫外处理后统计其萌发情况,以及在添加各种化学试剂的1/4 SDAY培养基上点滴接种后观察菌落生长情况。结果表明,在湿热处理后,ΔMaGti1、MaGti1ΔDOCK、MaGti1S75A、MaGti1T69A及ΔMaPac2的IT50相较于WT均显著提高;在紫外处理后,与WT相比,ΔMaGti1、MaGti1ΔDOCK、MaGti1S75A的IT50均显著降低,ΔMaPac2的IT50显著提高。这些结果表明MaGti1和MaPac2均参与蝗绿僵菌对紫外、湿热的耐受性,且MaGti1完整的Gti1/Pac2家族结构域对于真菌的抗逆能力十分重要。4.敲除MaGti1或MaPac2影响蝗绿僵菌毒力。为了研究MaGti1或MaPac2缺失是否影响蝗绿僵菌致病能力,采用体表点滴和体内注射的方式进行实验,发现体表点滴实验中,ΔMaGti1和ΔMaPac2的毒力均显著低于WT;之后在蝗虫后翅上分析了各菌株的附着胞形成率,结果显示,相较于WT的附着胞形成率,ΔMaGti1显著降低,ΔMaPac2在早期也显著降低,但在28 h,与WT没有差异。在体内注射试验中,ΔMaGti1和ΔMaPac2的毒力相较于WT均显著降低。表明MaGti1或MaPac2缺失均影响蝗绿僵菌的毒力。5.MaGti1调控蝗绿僵菌的产孢方式转换在微循环产孢培养基SYA上培养各菌株后发现,WT和ΔMaPac2可以微循环产孢,而ΔMaGti1(以及MaGti1ΔDOCK、MaGti1S75A)的产孢方式为正常产孢。为了进一步揭示MaGti1调控蝗绿僵菌的产孢方式转换的机制,收取SYA上培养12 h的WT和ΔMaGti1的菌体,进行转录组测序,结果表明,由于敲除蝗绿僵菌MaGti1基因引起的差异表达基因有228个（已知蛋白:86个（37.7%）;假定蛋白:142个（62.3%）;上调基因:91个（39.91%）;下调基因:137个（60.09%））。这些差异表达基因主要与产孢、菌丝生长、细胞膜、运输和毒力有关,表明MaGti1通过调节与菌丝生长、产孢等相关基因表达,从而调控产孢方式转换。
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