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目的:观察益糖康对DPN模型大鼠的神经保护作用;通过对各组大鼠背根神经节中BDNF/Trk B信号系统关键蛋白表达水平的检测,探讨益糖康对DPN模型大鼠BDNF/Trk B信号系统的干预作用;益糖康调控BDNF/Trk B系统下游信号通路ERK/CREB的调控作用;益糖康调控BDNF/Trk B系统另一下游信号通路PI3K/Akt的调控作用。材料与方法:大鼠适应性饲养一周后,将60只大鼠随机分为两组:空白对照组(8只),造模组(52只)。采用高脂饲料联合腹腔注射STZ法诱导糖尿病大鼠模型,模型复制成功后(复制成功41只),将造模组大鼠再次随机分为四组:模型对照组(11只)、高剂量组(10只)、中剂量组(10只)、低剂量组(10只)。按照文献方法进行糖尿病大鼠造模。造模组52只大鼠给予高脂饲料喂养,连续喂养4周后,于注射STZ前一天禁食不禁水,次日清晨腹腔注射链脲佐菌素(STZ,按照45mg/kg),注射72小时后检测空腹血糖。血糖达标后,继续以高脂饲料喂养。注射STZ 72小时后检测造模组大鼠空腹血糖,空腹血糖高于16.7mmol/l的大鼠认定为糖尿病模型大鼠。空白对照组:不作处理,正常饲料常规喂养至实验结束。模型对照组:不作处理,高脂饲料喂养至实验结束。高、中、低剂量组:分别以高、中、低剂量中药汤剂经口灌胃,2ml/100g体重,每日一次,然后分别以高脂饲料喂养至实验结束。以上各组末次给药后,热板法测定痛阈值,接下来以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,测定神经传导速度,然后处死大鼠,取双侧腰椎背根神经节,一侧浸泡于4%多聚甲醛溶液中,4℃保存备用;另一侧装入2ml冻存管,冻存于-80℃冰箱中,备用。采用血糖仪测定各组大鼠外周血糖水平;采用热板法检测各组大鼠热板反应潜伏期;采用生物信号采集系统测定各组大鼠的神经传导速度;采用TUNEL法检测各组大鼠背根神经节中细胞凋亡情况;采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠血清中BDNF含量;采用western-blot法检测各组大鼠背根神经节中BDNF、Trk B、p-Trk B、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、PI3K、Akt、p-Akt的表达水平。结果:1.模型评价结果:空白对照组和造模组大鼠血糖、热板反应潜伏期及神经传导速度检测结果显示,造模组大鼠血糖水平显著升高,热板反应潜伏期显著延长,神经传导速度减慢(p<0.01)。2.药物干预后,各组大鼠热板试验结果显示:与空白对照组比较,其余各组大鼠热板反应潜伏期明显延长,有显著的统计学差异(p<0.01);与模型对照组比较,高、中、低剂量益糖康干预组大鼠热板反应潜伏期显著缩短,有统计学差异(p<0.01);不同剂量组之间比较,均有显著的统计学差异(p<0.01),热板反应潜伏期随益糖康剂量的增大而缩短。3.各组大鼠神经传导速度检测结果显示:与空白对照组比较,其余各组大鼠神经传导速度显著减慢,有统计学差异(p<0.01);与模型对照组比较,高、中、低剂量益糖康干预组大鼠神经传导速度明显变快,有统计学差异(p<0.01);与低剂量组比较,高剂量组大鼠神经传导速度增快,有统计学差异(p<0.05)。4.各组大鼠背根神经节中细胞凋亡检测结果显示:空白对照组大鼠背根神经节中偶见凋亡细胞,模型对照组大鼠背根神经节中可见大量凋亡细胞。与空白对照组比较,其余各组大鼠背根神经节中凋亡细胞数明显增多,有显著性差异(p<0.01);与模型对照组比较,各治疗组凋亡细胞数显著减少,有显著性差异(p<0.01);三个剂量治疗组凋亡细胞数与剂量呈负相关,随剂量增大凋亡细胞显著减少(p<0.01)。5.各组大鼠血清BDNF含量测定结果显示:与空白对照组比较,其余各组大鼠血清BDNF含量显著降低,有统计学差异(p<0.01);与模型对照组比较,中剂量和高剂量组大鼠血清BDNF含量显著升高,有统计学差异(p<0.01);与低剂量组比较,中剂量和高剂量组大鼠血清BDNF含量升高,有统计学差异(p<0.01或0.05);与中剂量组比较,高剂量组BDNF含量升高,有统计学差异(p<0.05)。6.各组大鼠背根神经节中BDNF、Trk B及p-Trk B表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组及三个剂量治疗组大鼠背根神经节中BDNF、Trk B表达水平显著下调(p<0.01),p-Trk B表达水平也显著下调(p<0.01);与模型对照组比较,三个剂量治疗组BDNF、Trk B及p-Trk B表达水平上调(p<0.01或0.05);与低剂量组比较,中剂量组Trk B表达水平显著上调,高剂量组BDNF、Trk B及p-Trk B表达水平均显著上调(p<0.01);与中剂量组比较,高剂量组BDNF表达水平上调(p<0.05)。7.免疫荧光双标法检测背根神经节BDNF、Trk B表达水平结果显示:空白对照组镜下可见大量的BDNF阳性、Trk B阳性以及双阳性表达的细胞。与空白对照组比较,模型对照组及三个剂量治疗组大鼠背根神经节中BDNF、Trk B双阳性细胞数显著减少(p<0.01);与模型对照组比较,中、高剂量治疗组BDNF、Trk B双阳性细胞数显著增多(p<0.01);与低剂量组比较,中、高剂量治疗组BDNF、Trk B双阳性细胞数增多(p<0.01或0.05)。8.背根神经节ERK1/2表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组、中剂量组大鼠背根神经节中ERK1/2表达水平显著降低(p<0.01);与模型对照组比较,低、中、高剂量组ERK1/2表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,ERK1/2表达水平也升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。9.背根神经节ERK1/2表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低、中剂量组大鼠背根神经节中ERK1/2表达水平显著降低(p<0.01);与模型对照组比较,低、中、高剂量组ERK1/2表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,ERK1/2表达水平也升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。背根神经节p-ERK1/2表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组大鼠背根神经节中p-ERK1/2表达水平显著降低(p<0.01);与模型对照组比较,低、中、高剂量组p-ERK1/2表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,p-ERK1/2表达水平也显著升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01)。10.背根神经节CREB、p-CREB表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组、中剂量组大鼠背根神经节中CREB表达水平显著降低(p<0.01);与模型对照组比较,低、中、高剂量组CREB表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,CREB表达水平升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组大鼠背根神经节中p-CREB表达水平显著降低(p<0.01),高剂量组p-CREB表达水平升高(p<0.05);与模型对照组比较,低、中、高剂量组p-CREB表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,p-CREB表达水平升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。11.背根神经节PI3K表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组、中剂量组大鼠背根神经节中PI3K表达水平降低(p<0.01或0.05);与模型对照组比较,低中高剂量组PI3K表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,PI3K表达水平升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。12.背根神经节Akt、p-Akt表达水平检测结果显示:与空白对照组比较,模型对照组、低剂量组、中剂量组大鼠背根神经节中Akt表达水平降低(p<0.01或0.05);与模型对照组比较,低中高剂量组Akt表达水平均不同程度升高,有统计学差异(p<0.01);随着剂量增加,Akt表达水平升高,各组间比较,有统计学差异(p<0.01或0.05)。结论:1.益糖康可缩短糖尿病周围神经病变模型大鼠热板反应潜伏期,增加坐骨神经传导速度。2.益糖康可减少糖尿病周围神经病变模型大鼠背根神经节中细胞凋亡数量。3.益糖康可增加糖尿病周围神经病变模型大鼠血清BDNF水平。4.糖尿病周围神经病变并发症的发生与背根神经节中BDNF/Trk B表达水平密切相关。5.益糖康可能是通过调节DPN模型大鼠背根神经节中BDNF/Trk B的表达实现其抗凋亡作用,但具体的调控途径尚不清楚。6.糖尿病周围神经病变过程中,ERK/CREB信号通路受到抑制,这一变化可能与背根神经节中细胞凋亡数增加具有相关性,推测其作用机制可能是由于CREB的磷酸化调控了BDNF的表达水平而导致。7.益糖康对ERK/CREB信号通路具有调控作用,这一机制可能与益糖康具有抗背根神经节细胞凋亡作用相关,推测其调控过程可能是由于益糖康能够激活ERK/CREB信号通路,使CREB磷酸化增多,导致BDNF表达水平上调,从而发挥抗背根神经节细胞凋亡的作用。8.糖尿病周围神经病变中PI3K信号通路可能被抑制,从而导致下游关键蛋白CREB磷酸化水平的降低,减少了BDNF表达,导致背根神经节细胞凋亡的发生。9.益糖康对PI3K信号通路可能具有活化作用,同时促进了下游关键蛋白CREB磷酸化水平的升高,增加了BDNF的表达,发挥抗背根神经节细胞凋亡作用。