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猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP),是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种猪的传染性呼吸道疾病,是造成世界范围内养猪业经济损失的一个主要问题。临床上,该病以肺部有出血性,纤维素性渗出和坏死性损害为主要诊断特征,随着耐药菌株的出现而变得日趋难以应对。尽管目前很多与APP致病有关的毒力因子已被报道,但由于其调控网络错综复杂,它们在APP的整个感染和致病过程中究竟起着怎么样的作用,目前仍不完全清楚。双组份调控系统(Two-Component Regulatory System,TCS)是细菌感应外界环境变化最普遍的信号传递装置,通过感知外界环境信号变化并做出应答从而适应生长环境的变化。此外,在病原菌的感染过程中发挥着重要的作用,如调节细菌生长代谢、耐药性、毒力表达等。对已完成测序的APP血清3型JL03全基因组序列分析发现,在APP中共有五对双组份,分别是ArcA/ArcB, CpxA/CpxR, NarP/NarQ, PhoB/PhoR, QseB/QseC。CpxA/R是一个典型的对膜压做出调控反应的双组份调控系统,负责监控和维持外膜结构的完整性,参与菌毛的合成,调节毒力基因的表达。在多种病原菌致病中发挥重要作用。鉴于以上背景,本课题以目前国内流行的APP血清1型强毒株SLW01为亲本菌株,参照本实验室已经测序完成的APP血清3型JL03菌株全基因组测序结果,通过负向筛选和同源重组缺失了APP双组份调控系统CpxA/R基因,进一步开展了缺失突变株生物学特性及对小鼠毒力相关研究。主要研究内容包括：1.APP双组份调控系统双基因缺失突变株ACpxA/R及互补菌株C△CpxA/R构建与鉴定参照已测序JL03CpxA、CpxR基因序列,以SLW01基因组为模板,扩增CpxA/R双基因的上下游同源臂片段,通过T/A克隆将扩增的同源臂连接到PMD-18T载体上,酶切回收,依次连接到自杀性质粒pEMOC2上,酶切鉴定成功构建了缺失2300bp的重组自杀性质粒pEM-CpxA/R。经测序,同源臂序列与模板序列100%同源。将重组自杀性质粒pEM-CpxA/R转化到大肠杆菌β2155中并以此作为供体菌,与受体菌SLW01进行结合转移,获得整合了重组自杀性质粒pEM-CpxA/R的单交换菌株,利用负向筛选和同源重组的方法筛选出氯霉素敏感、蔗糖抗性的克隆,通过PCR鉴定,确定其发生了第二次的单交换。并进一步测序、Southern blotting证实双基因缺失突变株构建成功。参照APP血清3型JL03基因序列,设计引物,以SLW01基因组为模板,扩增出CpxA/R双基因序列,连接到APP-Escherichia. coli穿梭质粒PJFF224-XN上构建重组表达质粒PJFF-CpxA/R,将重组表达质粒电转化入双基因缺失突变株△CpXA/R,经PCR鉴定,互补菌株C△CpxA/R构建成功。2.双基因缺失突变株△CpxA/R生物学特性及对小鼠毒力研究为了检验CpXA/R缺失对细菌生长的影响,将SLW01、△CpxA/R、 C△CpxA/R划平皿复苏,挑取单菌落,37℃摇床过夜,1：1000转接,活菌计数,并根据OD600吸光值绘制生长曲线。从生长曲线看,缺失株△CpxA/R相比较SLW01、C△CpxA/R生长稍慢,但差异不显著。这说明CpxA/R的缺失对该菌的生长活性影响不大。将SLW01、△CpxA/R、C△CpxA/R的单菌落划区接种于10%新鲜绵羊血NAD平皿上,37℃温箱中放置24h,结果发现突变株与野生株和互补菌株的溶血活性差异不明显。选取六周龄Balb/C小鼠测定SLW01、△CpxA/R、C△CpxA/R三株菌的LD50,结果表明突变株△CpxA/R与野生株SLW01相比毒力下降5.36倍,而互补菌株与野生株基本无差异。细菌扫描切片电镜观察三株菌外观形态的变化,发现缺失株△CpxA/R的荚膜厚度与亲本株及互补菌株相比无明显改变,但形态发生了一定程度的改变,界线变得模糊。这说明△CpxA/R的缺失可能影响到了APP周质外膜蛋白的合成以及后期的折叠、加工等。利用PK-15细胞测试缺失株与野生株的黏附和侵入能力,发现△CpxA/R缺失后细菌的黏附和侵入能力均显著下降。利用小鼠巨噬细胞RAW测试缺失株与野生株的抗吞噬能力,结果显示△CpxA/R缺失后细菌更容易被吞噬杀死。以上结果表明：APP双组份调控系统缺失后导致细菌毒力降低。3.荧光定量筛选受调控的差异表达基因参考文献,通过生物信息学分析筛选出胸膜肺炎放线杆菌11个基因或蛋白与物质转运、菌毛合成、外膜蛋白相关,可能受CpxA/R双组份调控系统调控。通过荧光定量PCR检测,结果发现有8个基因发生显著差异表达,其中6个下调表达,2个上调表达。通过以上试验结果表明双组份调控系统CpxA/R可能通过调节细菌表面外膜蛋白、菌毛等毒力因子的表达从而影响APP的致病性。4.双组份调控系统调控蛋白Cpx/R表达和纯化参照已测序完成的JL03CpxR基因序列,以SLW01基因组为模板,扩增CpxR基因,通过T/A克隆将扩增序列连接到PMD-18T载体上,测序正确后,酶切回收CpxR并将其连接到原核表达载体pET-28a上,构建原核表达质粒pET-CpxR。将质粒pET-CpxR转化入BL21,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测其表达情况。结果IPTG诱导3小时,获得大小为24.24KD的CpxR调控蛋白。