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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是脑梗,冠心病,外周血管病等多种心血管疾病的主要诱因。随着生活水平的不断提高,AS的发病率也在迅猛增加。AS病变基础是脂质代谢障碍,斑块是由病变的血管细胞和凋亡细胞累积形成,斑块一旦破裂会造成血管栓塞进而引发脑卒中,危及人的生命健康。AS的发病机制尚未明确,因此临床上并没有特异性好且有效的动脉粥样硬化治疗药物。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是一种由脂肪细胞分泌的脂肪因子,在细胞内和细胞外都具有活性。Nampt是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成的限速酶,可将底物烟酰胺(NAM)转化成产物烟酰胺单核苷酸(NMN),NMN在催化条件下,生成NAD。NAD称作为辅酶I,是参与线粒体呼吸链氧化还原反应所必需的辅酶。NAD的生物学功能极其重要,可能能够直接决定着细胞的命运。本课题组前期基本证实了Nampt在脑缺血后发挥神经保护作用。动脉粥样硬化被认为是脑卒中的发病因素,但Nampt在AS中确切的作用尚未被证实。因此,我们采用体外补充Nampt酶产物NMN以及Nampt转基因小鼠与Apo E-/-杂交的Apo E-/-;NamptTg鼠来研究Nampt对动脉粥样硬化发生发展的影响,初步确定了Nampt可促进动脉粥样硬化的发生发展。本课题进一步研究了抑制TNF-α对动脉粥样硬化发生发展的影响,初步探讨了Nampt发挥作用的机制,从而为动脉粥样硬化的治疗提供了新靶点。实验方法:1.将8只8周龄左右的Apo E-/-雄性小鼠分为两组,对照组和实验组各4只,同时西方高脂饲料喂养,两个月后,实验组NMN饮水给药,给药剂量为300 mg/kg/天,对照组则继续普通饮水。观察NMN给药即体外补充Nampt酶产物NMN对AS小鼠主动脉上脂质沉积的影响。此外,采用油红O染色,HE染色,观察体外补充Nampt酶产物NMN,对AS小鼠斑块厚度及尺寸的影响,F4/80免疫组化染色观察主动脉根部斑块的巨噬细胞浸润情况,TNF-α免疫组化染色确定体外补充NMN对主动脉根部斑块的炎症因子表达情况的影响。2.将Nampt转基因鼠与世界上公认的动脉粥样硬化模型鼠Apo E-/-进行杂交,获得Apo E-/-;NamptTg鼠,作为实验组,以Apo E-/-小鼠作为对照组,西方高脂饲料喂养4个月。对小鼠进行主动脉油红O染色,观察Nampt转基因对AS斑块的影响。采用油红O染色,HE染色,观察Nampt转基因对动脉粥样硬化斑块的厚度和尺寸的影响;F4/80免疫组化检测巨噬细胞浸润情况,观察Nampt转基因对动脉粥样硬化斑块巨噬细胞浸润的影响;Masson染色,天狼星红染色,观察Nampt转基因对AS小鼠斑块纤维帽和胶原情况的影响;TNF-α,IL-1β免疫组化染色,观察Nampt转基因对AS小鼠斑块炎症因子表达水平的影响;ICAM-1,VCAM-1免疫组化染色,观察Nampt转基因对AS小鼠斑块中粘附及趋化因子的表达水平的影响;TUNEL实验,观察Nampt转基因对AS斑块中细胞凋亡数目的影响;此外,还进行了CD47免疫组化染色,初步探索了参与AS发生发展的可能机制。3.将6只Apo E-/-8周龄左右雄性小鼠,分为两组,对照组和实验组各3只,6只Apo E-/-;NamptTg 8周龄左右雄性鼠,分为两组,对照组和实验组各3只。同时西方高脂饮食4个月。实验组采用腹腔注射TNF-α抗体,剂量为5 mg/kg/天,给药一个月,随后进行了主动脉根部切片油红O染色,F4/80免疫组化染色,CD47免疫组化染色,α-SMA免疫组化染色,TUNEL细胞凋亡检测,进一步探索了Nampt对动脉粥样硬化发生发展影响的作用机制。实验结果:1.NMN饮水给药组与对照组(正常饮水)相比NMN给药组主动脉上脂质沉积较多,斑块面积和厚度较大,巨噬细胞浸润程度较高,炎症(TNF-α)表达水平升高。NMN促进了AS斑块增多和炎症浸润。2.Apo E-/-和Apo E-/-;NamptTg的主动脉油红O染色结果可以看出,相较于Apo E-/-组,Apo E-/-;NamptTg组的主动脉脂质沉积较多。Nampt转基因会使得斑块面积和厚度变大,巨噬细胞(F4/80)浸润程度加重,坏死中心扩大,III型胶原增多,并且炎症因子(TNF-α,IL-1β)表达水平升高,粘附和趋化因子(ICAM-1,VCAM-1)表达水平升高,斑块中细胞凋亡数量增多。3.Nampt转基因小鼠AS进程加快的同时也伴随着CD47表达水平的上调。抑制TNF-α不会对Apo E-/-和Apo E-/-;NamptTg AS小鼠的血脂和斑块面积产生影响,但F4/80和α-SMA的表达水平下降,即斑块炎症和纤维化得到了改善,此外,抑制TNF-α,CD47的表达水平也随之下调,斑块细胞凋亡也得到了抑制。实验结论:1.通过体外补充Nampt的酶产物NMN,可促进AS的发生发展,体现为斑块面积的显著增加和炎症的增强。2.和野生型小鼠相比较,在Nampt转基因小鼠上使用高脂饮食诱导的AS发生发展进程明显加快,主要体现为斑块面积的增加;此外,Nampt转基因小鼠的斑块组织中的炎症细胞浸润、炎症因子的表达均增加,提示斑块的稳定性明显变差。3.使用中和抗体注射抑制TNF-α,可以延缓Nampt转基因鼠的AS进程;Nampt转基因鼠AS斑块中CD47表达水平升高,而当TNF-α被中和抗体抑制后,CD47的表达水平也随之降低。提示TNF-α-CD47通路可能参与了Nampt促进AS发生发展的作用。