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自噬是细胞内溶酶体介导的降解机制,用于细胞质的更新代谢。无论是在形态上,还是在构成自噬核心机制的蛋白组成方面,从酵母乃至人类的所有真核生物中,自噬都高度保守。自噬在细胞发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制和神经退行性疾病等方面发挥着重要作用。然而,自噬程度过强或过弱都可能不利于细胞生长。因此,细胞维持适当的自噬水平十分重要。据此,本文以Saccharomyces cerevisiae BY4741菌株为实验对象,采用Cre-loxp基因编辑技术构建TOR1、SCH9、RAS2基因敲除突变株,并通过基因的叠加敲除实现对自噬强度的调控,分析自噬强度与细胞寿命之间的关系,并获得寿命延长的酵母突变株,取得了如下结果:1.以S.cerevisiae BY4741菌株为出发菌,利用Cre-loxp技术编辑S.cerevisiae BY4741的TOR1、SCH9和RAS2基因,PCR扩增三个目的基因的上下游片段并进行拼接,与p Easy Blunt zero cloning vector连接转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒酶切后,与p DC10酶切片段连接,成功构建了3个基因的重组敲除质粒,分别为:p Easy B-RAS2::hpt II、p Easy B-SCH9::hpt II和p Easy B-TOR1::hpt II。PCR扩增同源重组组件后导入S.cerevisiae BY4741,获得了S.cerevisiae BY4741Δras2、S.cerevisiae BY4741Δsch9、S.cerevisiae BY4741Δtor1突变株,利用质粒p SH65去除整合到基因组内抗性表达框,对基因进行叠加编辑,获得了S.cerevisiae BY4741Δras2Δsch9、S.cerevisiae BY4741Δras2Δtor1、S.cerevisiae BY4741Δtor1Δsch9和S.cerevisiae BY4741Δtor1Δsch9Δras2突变株。2.以出发菌和七株突变株为实验菌株,利用细胞自噬检测试剂盒对自噬小泡选择性标记,在共聚焦显微镜下观察染色情况,使用标准的FITC滤波器成像,所有突变株的激光强度、电压值、增益、扣除背景在成像时与出发菌保持一致。利用Ipp 6.0计算自噬强度,以测量对象的面积和平均光密度为参数,对自噬强度进行测定。根据自噬强度结果分析可知S.cerevisiae BY4741Δtor1Δsch9Δras2的自噬程度最强,七株突变株的自噬程度均强于出发菌S.cerevisiae BY4741。3.将八株菌分别涂布于SDC培养基上,将第3天CFUs的数量作为初始生存期（100%生存期）,根据死亡率调整稀释倍数和体积,每48小时取样进行涂布,直到存活率为1%,据此测定八株菌的时序寿命。根据时序寿命曲线图结果分析可知,S.cerevisiae BY4741Δras2Δsch9、S.cerevisiae BY4741Δtor1Δsch9和S.cerevisiae BY4741Δtor1Δsch9Δras2突变菌株的时序寿命减少;突变株S.cerevisiae BY4741Δras2Δtor1、S.cerevisiae BY4741Δsch9、S.cerevisiae BY4741Δtor1和S.cerevisiae BY4741Δras2的时序寿命得到延长。出发菌S.cerevisiae BY4741的时序寿命为35天,突变株S.cerevisiae BY4741Δras2Δtor1的时序寿命为43天,S.cerevisiae BY4741Δsch9的时序寿命为41天,S.cerevisiae BY4741Δtor1的时序寿命为39天,S.cerevisiae BY4741Δras2的时序寿命为37天。突变株S.cerevisiae BY4741Δras2Δtor1的时序寿命为出发菌的1.22倍;S.cerevisiae BY4741Δsch9的时序寿命为出发菌的1.17倍;S.cerevisiae BY4741Δtor1的时序寿命为出发菌的1.11倍。S.cerevisiae BY4741Δras2的时序寿命为出发菌的1.06倍。4.获得了时序寿命为出发菌1.22倍的突变株S.cerevisiae BY4741Δras2Δtor1,其时序寿命和自噬程度均明显提高。通过分析细胞自噬强度与时序寿命之间的关系,发现在一定范围内,随着自噬强度的增强,时序寿命显著延长,但当自噬强度超过某一极限时,寿命反而降低。