论文部分内容阅读
目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体，制备其单克隆抗体及多克隆抗体并进行初步鉴定，通过Westen-blot检测其特异性，利用免疫组化研究其在肿瘤治疗上的应用价值。 方法: 1、目的基因的获得及重组表达载体的构建 设计针对NY-ESO-1的特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段，经上下游引物所引入的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游，构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1。 2、细菌培养 将载体pGEX-4T1-NY-ESO-1转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中，进行细菌培养。 3、目的蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 用IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白，经不同浓度尿素洗脱纯化后，表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法鉴定获得NY-ESO-1/GST融合蛋白。 4、单克隆抗体制备 用NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫BALB/c小鼠，采用传统方法制备抗NY-ESO-1单克隆抗体，通过细胞融合，HAT选择，有限稀释法克隆扩增，获得NY-ESO-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 5、多克隆抗体制备 将NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫家兔制备NY-ESO-1多抗血清，获得NY-ESO-1多克隆抗体。 6、抗体的鉴定及免疫组化 通过间接ELISA法测定抗体效价，Western-blot检测其的特异性。利用免疫组化技术研究其在正常睾丸组织和癌组织检测中的应用价值。 结果:重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明，表达产物的相对分子质量(Mr)为44000，与理论值相符，并主要以包涵体形式存在，Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应，提示为融合蛋白。通过单克隆抗体的制备，免疫获得了1株抗NY-ESO-1单克隆抗体细胞株，经过间接EL1SA检测，抗体效价为10-7，经Westem blot和免疫组化等鉴定，抗体的特异性良好，与载体蛋白GST无交叉反应。免疫家兔后获得高效价NY-ESO-1抗血清，Westem blot检测证实该血清特异性较好。通过免疫组化技术检测结果显示可见其目的基因在正常睾丸组织和癌组织中均有表达。 结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1，利用大肠杆菌表达系统，获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白，成功建立了1株抗NY-ESO-1单克隆抗体细胞株，由于Western blot鉴定结果良好，同时成功制备兔抗人NY-ESO-1多克隆抗体，通过检测，结果良好，为NY-ESO-1生物学功能研究奠定了基础。