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近年来创伤、炎症、肿瘤等原因导致骨缺损发生率一直居高不下,如何优化骨缺损修复治疗方案是亟待解决的难题。其中,改善缺损局部微环境,协调免疫活动、神经血管长入等局部反应和组织再生过程对于进一步促进骨缺损修复具有重要意义。骨膜在骨日常代谢以及骨缺损修复过程中发挥关键的调控作用:（1）骨膜内丰富分布的神经血管为骨组织提供神经血管支配来源;（2）骨膜含有丰富的局部免疫细胞和干细胞储备,在条件刺激下积极响应调节骨代谢和骨再生;（3）骨膜具有对细胞的选择性屏障能力,可为骨缺损修复维持良好的修复空间。针对天然骨膜的结构和功能,构建仿生膜材料,覆盖于缺损表面以调节骨缺损修复微环境,配合具备骨诱导性和骨传导性的骨缺损填充材料,有望进一步促进骨缺损修复。目前已有研究设计出针对促进血管化或调节巨噬细胞极化的仿骨膜类材料。然而,现有材料对神经生长及局部复杂免疫微环境的调控能力不足,改善骨缺损修复效果有限。氧化铈具有调控微环境的运用潜力,相关研究报道氧化铈纳米颗粒能够促进骨组织再生与血管再生,也有研究报道其具有免疫调节与神经保护作用。利用氧化铈构建仿生骨膜调控骨缺损修复局部微环境,可能是进一步改善骨缺损修复治疗效果的潜在方案。然而传统氧化铈纳米颗粒在体内降解代谢问题上存在争议,且构建材料需要依靠复杂的纳米颗粒制备技术,这大大掣肘其相关生物材料的发展。仿生矿化是在体外利用生物矿化的原理,以有机支架为模板诱导无机元素在其内有序沉积,形成具有精美有序结构的有机-无机复合材料。氧化铈作为无机成分,具备作为矿化基材的潜力,有望在天然膜材料鸡蛋膜内形成氧化铈仿生矿化。这种仿生矿化方案在简化材料制备方式的同时,能够制备出独特状态的氧化铈矿化成分,作为负载于鸡蛋膜有机支架上的生物活性成分,发挥调节骨缺损修复微环境的作用。本研究借鉴仿生矿化领域前沿研究成果,首次提出了利用聚丙烯酸（High molecular weight polyacrylic acid,HPAA）预处理有机支架材料,诱导乙酰丙酮铈缓慢水解形成无定形氧化铈,实现鸡蛋膜纤维内部仿生矿化的方案。氧化铈仿生骨膜是以无定形氧化铈（III价,IV价组成）无机矿物在鸡蛋膜有机支架（胶原成分和糖胺聚糖成分）内部有序沉积为特征的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜材料,具有良好的生物安全性。利用于小鼠颅骨缺损模型,将仿生骨膜与骨缺损填充材料Bio-Oss配合使用,探索仿生骨膜调节缺损局部免疫反应、神经血管长入以及改善骨再生和骨膜再生的效果。随后,通过氯膦酸盐脂质体注射构建小鼠体内单核巨噬细胞清除模型,研究单核巨噬细胞在骨缺损修复过程中的作用。并结合体外细胞实验和共培养技术探索氧化铈仿生骨膜对巨噬细胞早期破骨分化和分泌功能的影响及作用机制,初步探讨巨噬细胞分化形成的破骨前体细胞在组织再生过程中的调节作用。本实验构建的仿生骨膜有望作为骨缺损修复治疗方案的辅助手段改善骨缺损修复效果,同时破骨前体细胞促组织再生作用机制有望为新型骨缺损修复材料的设计提供新思路和新作用靶点。1.研究方法在第一部分实验中,通过以鸡蛋膜为矿化模板、氧化铈为矿化基材、胶原酶和聚丙烯酸为支架预处理剂的氧化铈仿生矿化方案,以由下而上的方式实现氧化铈在鸡蛋膜纤维胶原及糖胺聚糖内的均匀有序沉积,构建氧化铈仿生矿化的鸡蛋膜材料。随后,我们对材料性能进行系列评价:采用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）、扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy,SEM）、扫描透射电子显微镜能谱分析技术（Scanning transmission electron microscopy-energy dispersed X-ray analysis,STEM-EDX）观察氧化铈仿生矿化后鸡蛋膜显微结构特点和矿化分布特征;运用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪（Attenuated total reflection–fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR）、Raman光谱、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、热重分析（Thermogravimetric analysis,TGA）判断矿化前后鸡蛋膜支架内的矿物成分及矿化程度,并初步分析矿化原理;结合X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）分析矿化材料内铈元素的价态分布;原子力显微镜（Atomic force microscope,AFM）评价分析鸡蛋膜矿化前后弹性性能变化;采用人来源口腔黏膜成纤维细胞（Human oral mucosa fibroblast cells,h OMFs）模拟结缔组织细胞对膜的穿透过程,结合鬼笔环肽染色评价材料对软组织细胞的物理屏障作用。同时,我们采用体内小鼠皮下植入模型和体外细胞实验对氧化铈仿生矿化鸡蛋膜进行系列生物安全性能评价:将材料植于小鼠皮下,进行血液淋巴细胞流式分析和血浆酶联免疫吸附测定实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）评估系统炎性反应程度,结合植入区域组织苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin stain,H＆E stain）观察植入局部炎性反应程度;体外运用不同浓度材料浸提液刺激h OMFs,通过细胞增殖活性（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验和Annexin V-PI凋亡坏死流式分析评价材料的生物相容性。通过上述对材料的系统性表征,为仿生骨膜在组织再生领域中的应用提供扎实的实验基础。第二部分实验对氧化铈仿生骨膜调节小鼠颅骨缺损微环境促进骨缺损修复的效果进行评价:针对缺损局部免疫微环境调节效果及神经血管长入情况进行了初步评估,并评价运用仿生骨膜促进骨膜再生及骨组织再生的作用。在临床传统方案使用Bio-Oss骨粉填充骨缺损的基础上,配合使用仿生骨膜覆盖在填充有骨粉的缺损表面进行小鼠颅骨缺损修复。随后,运用感觉神经标志分子降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide,CGRP）和血管标志分子CD31的免疫荧光染色对缺损局部微环境内神经血管长入情况进行表征。通过体外材料刺激下单核巨噬细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色、免疫荧光染色实验观察氧化铈仿生骨膜对单核巨噬细胞早期破骨分化的影响,结合体内免疫荧光染色和三维重建技术,观察骨缺损修复局部单核巨噬细胞分布特征和活化特点,从而评价氧化铈仿生骨膜对缺损修复免疫微环境的调控作用。运用Micro-CT和Von Kossa染色评价骨组织再生效果,同时采用H＆E染色、Van Gieson染色和免疫荧光染色评价骨膜再生效果,从而对氧化铈仿生骨膜改善骨缺损修复的效果进行综合评价。第三部分实验围绕氧化铈仿生骨膜调节缺损修复微环境的作用机制进行初步探索。首先通过体内注射氯膦酸盐脂质体清除单核巨噬细胞,通过Micro-CT、von-Kossa染色、免疫荧光染色发现体内骨组织再生和骨膜再生明显受到抑制,缺损修复局部微环境内神经血管长入明显减少。初步验证猜想:单核巨噬细胞在缺损修复过程中参与调节缺损修复微环境内神经血管长入,同时对骨组织再生、骨膜再生具有重要作用。体外提取小鼠单核巨噬细胞,通过氧化铈仿生骨膜刺激,结合实时定量PCR实验和免疫荧光染色,检测相应材料刺激下单核巨噬细胞对组织再生相关细胞因子表达水平的变化。进一步通过细胞共培养、SEM观察、细胞迁移实验和ELISA实验观察不同材料刺激条件下单核巨噬细胞对雪旺细胞粘附、迁移、营养神经能力的调控作用;运用中和抗体实验,辅助探明系列细胞因子当中对雪旺细胞粘附、迁移、营养神经能力的主要作用因子,从而初步阐明以单核巨噬细胞调控作用为基础的氧化铈仿生骨膜调节骨缺损修复微环境的作用机制。2.实验结果第一部分氧化铈仿生骨膜的构建与表征1)扫描电镜和动态光散射实验观察发现,当利用0.24 g乙酰丙酮铈与0.1 m L水的缓慢水解反应构建氧化铈矿化前体液时,能够在24 h内保证氧化铈矿化前体液处在较稳定的状态,其内含分散均匀的直径为80-90 nm的前体颗粒。2)经筛选,采用100 m U/μL I型胶原酶和6.67x10-4 M的聚烯丙基胺盐酸盐对鸡蛋膜进行预处理,结合每24 h更换氧化铈矿化前体液,能够实现鸡蛋膜纤维双成分（胶原蛋白核心和糖胺聚糖外壳层）的均匀、充分氧化铈仿生矿化。3)扫描电镜观察显示,氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和小鼠颅骨骨膜在表面微观结构上具有相似性:两者都是由纤维相互交织形成的膜结构,直径为100-200 nm,两者的纤维走行与交织方式也具有很高的相似性。4)鸡蛋膜矿化后矿化成分为3价铈与4价铈共存的无定形氧化铈:XRD结果验证矿化鸡蛋膜纤维内矿化成分为短程有序、长程无序的无定形状态;ATR-FTIR实验和Raman实验结果证明Ce-O键存在且局部类似氧化铈排列模式,说明矿化后鸡蛋膜内含氧化铈成分;XPS实验显示矿化后鸡蛋膜内3价铈与4价铈的比例为48.4±2.1:51.6±1.4;TGA实验结果说明氧化铈仿生矿化过程所引入的矿化成分约占总质量的18.82%。5)氧化铈仿生骨膜具有显著增强的机械性能、可靠的屏障性能和缓释能力、以及良好的生物安全性:AFM力学模式检测显示,经历矿化后鸡蛋膜的弹性模量得到显著提高（P＜0.05）;体外细胞穿透实验证实氧化铈仿生骨膜具有良好的物理屏障功能;ICP实验结果显示氧化铈仿生骨膜具有缓慢释放铈的特点;体外细胞实验证实材料在一定浓度范围内未引发细胞增殖和凋亡活动的明显改变;小鼠体内皮下植入模型提示氧化铈仿生骨膜未引发局部和系统显著炎症反应,机体反应在术后14天时与对照假手术组无显著差异,说明氧化铈仿生骨膜具有良好的生物安全性。这些实验结果初步证明了氧化铈仿生矿化鸡蛋膜作为生物膜材料的可行性。第二部分运用氧化铈仿生骨膜调节骨缺损修复微环境的效果评价6)仿生骨膜具有调节缺损局部微环境内神经血管长入的作用:免疫荧光染色发现术后2周和4周,仿生骨膜的运用显著促进新生骨膜区和骨缺损区这两个区域内的神经血管长入（P＜0.05）。7)仿生骨膜具有调节缺损局部免疫微环境的作用:TRAP染色和免疫荧光染色结果显示,体外氧化铈复合鸡蛋膜浸提液刺激下TRAP阳性单核巨噬细胞显著增多（P＜0.05）,且荧光染色结合4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染核结果发现这种TRAP阳性细胞为处于单个核阶段的破骨前体细胞。小鼠颅骨缺损运用仿生骨膜后观察到单核巨噬细胞沿新生骨膜区域中外层分布,且转为TRAP阳性的破骨前体细胞。8)仿生骨膜的运用显著促进骨再生:小鼠颅骨缺损术后4周运用显微CT（MicroCT）评价较早期的成骨效果,结果显示氧化铈仿生矿化鸡蛋膜组在4周时就实现了较好的愈合效果,有大范围新生骨覆盖缺损区域,效果明显优于其他组别（P＜0.05）;术后8周运用Micro-CT和von-Kossa染色评价较后期的成骨效果,观察到在8周时氧化铈仿生矿化鸡蛋膜组实现良好的缺损区骨再生,骨矿物质密度（BMD）、松质骨厚度（Tb.Th.）和骨体积分数（BV/TV）结果显著优于其他组别（P＜0.05）,组织形态观察新生骨与周围正常骨之间没有明显分界,且新生骨组织内可见类似于正常骨髓组织的骨髓腔结构。9)仿生骨膜的运用显著促进骨膜再生:H＆E染色、Van Gieson染色结果显示,术后4周缺损区域新长入硬组织表面观察到覆盖有一层纤维结缔组织,与自然骨膜的结构特征类似,在氧化铈仿生矿化鸡蛋膜组表现为与自然骨膜具有高度相似性的层次结构体:上层比较致密由纤维结缔组织交织形成,下层较为疏松且富含小血管。并且,仿生骨膜组实现了骨膜组织厚度以及骨膜素Periostin表达显著高于其他组的骨膜再生效果（P＜0.05）第三部分氧化铈仿生骨膜调节骨缺损修复微环境的机制探索10)通过在小鼠体内腹腔注射配合局部注射氯膦酸盐脂质体,实现了在缺损局部非特异性清除单核巨噬细胞的效果,该组小鼠的骨组织再生、骨膜再生以及缺损修复局部微环境内神经血管长入程度均受到了显著抑制（P＜0.05）。11)单核巨噬细胞在仿生骨膜刺激下形成TRAP阳性破骨前体细胞。该破骨前体细胞中神经轴突导向因子Slit3和生长因子血小板衍生生长因子BB（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的基因和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。氧化铈仿生骨膜刺激下,单核巨噬细胞内P38蛋白磷酸化和m TOR蛋白磷酸化明显上调（P＜0.05）。12)氧化铈仿生骨膜刺激下,单核巨噬细胞与雪旺细胞共培养能够显著促进雪旺细胞的黏附能力、迁移能力以及神经营养作用（P＜0.05）。分别添加或混合添加Slit3和PDGF-BB中和抗体显著降低雪旺细胞伸展面积（P＜0.05）;分别或混合添加Slit3、PDGF-BB和VEGF中和抗体时,雪旺细胞迁移数量有显著降低（P＜0.05）;添加Slit3中和抗体时神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的基因表达水平和分泌水平受到明显抑制（P＜0.05）。3.研究结论1)本实验成功建立了鸡蛋膜氧化铈仿生矿化方案:鸡蛋膜经胶原酶处理后,能够获得更加松散的有机支架结构,有利于矿化前体的渗透,为鸡蛋膜的仿生矿化提供了可能;利用乙酰丙酮铈的缓慢水解实现氧化铈矿化前体成分的供应,每24 h换液维持矿化前体的充足供应,防止其不稳定沉积时对矿化通道的干扰与堵塞;HPAA聚阴离子电解质预处理改变鸡蛋膜支架表面带电情况,且带有的羧基可能与铈原子产生螯合作用,可以吸引并促进氧化铈矿化成分对鸡蛋膜纤维的粘附、渗透,占据鸡蛋膜纤维胶原核心成分和糖胺聚糖外壳层内部的空隙;矿化7天后的加热处理进一步引导液相氧化铈前体在鸡蛋膜纤维内部的沉积,并催化水合氧化铈的脱水,从而形成稳定的鸡蛋膜氧化铈仿生矿化。2)鸡蛋膜的纤维交织结构对仿生骨膜的构建具有重要意义,一方面鸡蛋膜与自然骨膜在表面微观结构上具有高度相似性,具有良好的界面拓扑特征;另一方面交织的纤维阻碍细胞的穿透以屏障软组织在骨缺损区域的长入,有利于维持无软组织渗透干扰的缺损修复微环境。3)氧化铈矿化鸡蛋膜中的无机成分为3价和4价铈共存的无定形氧化铈成分,一方面为鸡蛋膜提供了机械性能的提升;另一方面铈能够从仿生骨膜内缓慢释放,具有良好的生物相容性和调节骨缺损修复微环境的生物活性。在运用氧化铈仿生骨膜时,小鼠颅骨缺损实现了更快的骨组织再生和骨膜再生,以及缺损修复局部免疫微环境和神经血管长入情况的改善。4)氧化铈仿生骨膜在骨缺损修复过程中的作用机制是依靠单核巨噬细胞的早期破骨分化及其调控组织再生作用。体外和体内实验结果表明氧化铈仿生矿化骨膜引导缺损局部免疫微环境的调整,使免疫先锋细胞单核巨噬细胞转归为TRAP阳性的破骨前体细胞,分泌Slit3、PDGF-BB和VEGF等细胞因子参与调节组织再生。这些分泌的细胞因子对于雪旺细胞的粘附、迁移、神经营养能力都具有促进作用,从而能够促进缺损区域神经再长入。综上所述,氧化铈仿生矿化方法的提出为骨缺损修复领域材料的构建提供了新思路,通过传统填充材料加仿生骨膜的模式改善骨缺损修复效果;所构建的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜具有作为仿生骨膜促进骨缺损修复和改善缺损局部免疫-神经血管微环境的作用;同时我们提出了材料促进单核巨噬细胞早期破骨分化、调节局部神经血管长入从而改善骨缺损修复效果的作用机制,有望为后续材料设计方案改进和相关修复方案研究提供新的参考靶点。