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布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）感染导致的人畜共患传染病。临床上主要表现为流产、死胎、睾丸炎、关节痛等症状，对畜牧业生产造成巨大的经济损失，同时严重威胁人类健康。巨噬细胞作为机体防御病原入侵和向免疫系统呈递病原信息的细胞，是布鲁氏菌侵染的主要靶细胞。布鲁氏菌在感染宿主的过程中，细菌的外膜蛋白首先与巨噬细胞发生互作完成侵染过程，通过逃避机体免疫，在细胞中存活和繁殖，导致疾病的发生。Omp25作为重要的毒力因子，在布鲁氏菌感染致病过程中起着至关重要的作用。有研究报道，TNF-α作为免疫反应重要的细胞因子，能够有效地对抗机体布鲁氏菌感染，布鲁氏菌感染可抑制巨噬细胞TNF-α的产生，但Omp25对巨噬细胞TNF-α的产生是否有作用，其作用机制如何尚不明确。本研究拟以灭活的猪种布鲁氏菌为模板，构建Omp25和Omp31慢病毒表达载体，完成慢病毒的包装和浓缩。然后，MTT确定慢病毒感染巨噬细胞的最佳浓度和时间，流式细胞术、Q-PCR检测Omp25和Omp31对巨噬细胞周期和凋亡的影响。ELISA检测Omp25对巨噬细胞产生TNF-α的影响，双荧光素酶、Q-PCR和western blotting确定参与调控TNF-α产生的miRNAs和参与调控TNF-α产生的关键信号通路。最后，明确Omp25对巨噬细胞TNF-α产生的信号通路和miRNA的调控机制。研究结果将阐明Omp25对巨噬细胞TNF-α产生的调控作用和机制，为进一步探讨布鲁氏菌逃避宿主免疫反应的机制提供理论依据。研究取得如下结果。 1.PCR克隆Omp25和Omp31编码基因，BamH I和EcoR I双酶切后连接转化Stabl3感受态细胞，经鉴定和测序分析，筛选获得正确的重组慢病毒表达质粒pCDH-CMV-omp25-Flag-EF1-copGFP和pCDH-CMV-omp31-Flag-EF1-copGF。将慢病毒表达质粒、被膜质粒PMD2.G和骨架质粒psPAX2共同转染HEK-293T细胞，分别获得Omp25和Omp31慢病毒（Lv-Omp25和Lv-Omp31），RT-PCR和western blotting检测显示慢病毒表达大小约为26kDa Omp25和30kDa Omp31。 2.以不同浓度梯度和时间梯度的慢病毒感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs），MTT结果显示，Lv-Omp25和Lv-Omp31感染对猪肺泡巨噬细胞活性没有影响（p>0.05），当慢病毒以100MOI浓度感染36h时，显微镜观察Omp25和Omp31在PAMs中均有表达，且对细胞生长活性无显著影响（p>0.05）。流式细胞术检测细胞周期结果显示，与Lv-Blank相比，Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后细胞G0/G1、S以及G2/M期均未见显著差异（p>0.05）。流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后巨噬细胞的凋亡率分别是10.3%、9.1%和10.3%，差异不显著（p>0.05）。 3.Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31分别感染PAMs和RAW264.7，western blotting结果显示，Omp25和Omp31能够稳定表达；ELISA和Q-PCR检测显示，相比于Lv-Blank和Lv-Omp31，Lv-Omp25可以显著下调LPS诱导的TNF-α、IL-12p40和IL-6表达（p<0.01），但对IL-1β没有显著作用（p>0.05），同时双荧光素酶活性检测显示，Lv-Omp25可以显著下调LPS诱导的TNF-α启动子活性（p<0.01）。 4.Lv-Blank和Lv-Omp25分别感染PAMs和RAW264.7，Q-PCR检测显示，Omp25上调miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平（p<0.05,p<0.01）。转染不同miRNAs mimics，ELISA和Q-PCR检测显示，miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b和miR-301a-3p显著降低了LPS诱导的TNF-α产生，miR-146a和miR-351-5p参与抑制TNF-α转录；western blotting检测结果显示，miR-146a mimics和miR-351-5p mimics显著抑制TRAF6和IRAK1的表达（p<0.05）。Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7，western blotting检测结果发现，Lv-Omp25感染的细胞TRAF6和IRAK1表达减少，而转染miR-146a和miR-351-5p抑制剂则可上调TRAF6和IRAK1的表达；Q-PCR检测显示，miR-146a和miR-351-5p抑制剂都可上调TNF-α的转录水平（p<0.05）。上述miRNA特异抑制剂转染PAMs和RAW264.7后用Lv-Blank和Lv-Omp25感染细胞，ELISA检测显示，相对于非特异性miRNA抑制剂转染细胞，特异性miRNA抑制剂转染的细胞中TNF-α的产生水平显著提高，同时miRNA特异性抑制剂混合转染可使TNF-α的表达水平基本恢复到对照组水平（p<0.05）。 5.Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7发现，Lv-Omp25感染可抑制NF-κB转录活性，同时Lv-Omp25能够减少胞核中p65和胞质p-IκB的表达（p<0.05，p<0.01），而对p50和IκB的表达没有影响（p>0.05）。miR-146a和miR-351-5p抑制剂转染Lv-Omp25感染的细胞结果发现，在PAMs中miR-146a抑制剂显著增加p-IκB的水平；在RAW264.7细胞中，miR-146a和miR-351-5p抑制剂都能增加p-IκB的水平，而对IκB表达没有影响。Lv-Omp25感染可增加JAK-2和SOCS1的表达，降低SOCS3的表达，同时降低p-STAT1的水平和上调p-STAT3的水平，而不影响JAK-1和JAK-3的表达。用JAK2-STAT3信号通路抑制剂处理Lv-Blank和Lv-Omp25感染的PAMs和RAW264.7，结果显示，抑制JAK2-STAT3信号通路可显著地抑制Lv-Omp25感染对TNF-α表达的抑制作用；此外，AG490可显著抑制细胞Lv-Omp25诱导的miR-146a和miR-181a-5p水平，而对miR-130a-3p、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平没有影响。 本研究成功构建了表达Omp25和Omp31的慢病毒表达载体，获得高滴度慢病毒。用包装的慢病毒成功感染PAMs，并能稳定表达Omp25和Omp31。Omp25和Omp31不参与调节巨噬细胞周期调控和诱导细胞凋亡的发生。Omp25可显著降低PAMs和RAW264.7TNF-α、IL-12p40和IL-6的表达，且Omp25可抑制TNF-α启动子的活性，而Omp31没有此作用。Omp25可上调与TNF-α抑制有关的miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平。其中miR-130a-3p、miR-181a和miR-301a-3p通过靶向TNF-α3UTR直接抑制TNF-α的表达，而miR-146a和miR-351-5p通过直接靶向TRAF6和IRAK1蛋白，进而抑制TNF-α的转录。Omp25可通过上调miR-146a和miR-351-5p抑制NF-κB信号通路的活化，同时通过激活JAK2-STAT3信号通路上调miR-146a和miR-181a-5p进而抑制TNF-α的表达。上述研究结果阐明了布鲁氏菌Omp25抑制巨噬细胞TNF-α产生的作用和调控机制，为更深入探讨布鲁氏菌逃避宿主免疫的机理奠定了基础。