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该次试验将携带毒蕈碱受体m3亚型的基因转染到CHO-K1细胞中,建立稳定表达的含有单一毒蕈碱受体m3受体亚型的细胞系,并采用撤血清诱导CHO细胞凋亡模型.研究激动m3受体对凋亡的细胞作用并探讨与此相关的信号转导通路,采用m3单克隆抗体探讨不同条件下CHO细胞中m3受体表达情况.方法:1、采用脂质体包裹的方法将携带有毒蕈碱受体m3亚型基因的PCDNA的质粒经扩增纯化后,转染至CHO-K1细胞内,建立稳定表达单一毒蕈碱受体m3受体亚型的细胞系.2、采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western-blotting检测CHO细胞表面毒蕈碱受体m3受体亚型的表达.3、应用撤血清的方法诱导含有毒蕈碱受体m3受体亚型的CHO细胞凋亡,凋亡指标包括MTT观察细胞存活率、Hoechst33258观察细胞核、FDA观察细胞形态的改变,DNAladder分析DNA降解.4、观察毒蕈碱受体激动药氨甲酰胆碱及其阻断剂阿托品对细胞凋亡的影响.5、RT-PCR检测m3受体转录水平在撤血清诱导的CHO-m3细胞凋亡过程中的动态变化.6、Western blottingting检测在撤血清诱导的CHO-m3细胞凋亡过程中m3受体表达的动态变化.7、Western blottingting研究细胞内c-jun、ERK1/2的磷酸化水平的改变.结论:1、将携带有毒蕈碱受体m3受体亚型的cDNA的质粒成功转染至CHO细胞,获得稳定的表达.2、毒蕈碱受体激动剂氨甲酰胆碱可抑制撤血清诱导的CHO-m3亚型的细胞凋亡.毒蕈碱受体阻断剂阿托品及JUNK通路抑制剂均可阻断Cch的保护作用.3、Cch引起m3受体转录水平和表达水平增加.4、Cch对的保护作用可能通过激活JNK通路实现的.ERK1/2通路不参与m3受体介导的保护作用.