ARPK1在拟南芥种子萌发和幼苗生长中的作用的初步研究

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脱落酸(abscisic acid,ABA)在植物生长和发育过程中具有极其重要的调控作用。尽管人们对于ABA的核心信号通路已经有了一定的了解,但是参与其中的其它相关基因的分子调控机制仍需解答。本论文初步研究了ARPK1(ABA Responsive Protein Kinase 1)在拟南芥种子萌发和幼苗生长中的作用。通过分析功能缺失突变体arpk1-1(T-DNA插入突变体株系)和arpk1-2(CRISPR-Cas9株系)以及两个过量表达株系ARPK1OE#1和ARPK1OE#2的表型,我们发现与野生型(Col-0)相比较,缺失突变体的种子萌发和幼苗的主根生长对ABA及其相关的非生物胁迫处理(如高盐、高渗、高糖)呈现敏感的表型,而过量表达株系则敏感性减弱;我们还注意到,ABA和非生物胁迫处理能够导致缺失突变体幼苗根中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过量积累。进一步研究发现,作为ABA信号通路调控因子之一的ABI4(Abscisic Acid Insensitive 4)能够促进ARPK1的表达,遗传学实验结果显示,ABI4可能对ARPK1具有上位效应。主要研究结果如下:1.与Col-0相比,缺失突变体arpk1-1和arpk1-2在施加外源ABA的MS培养基上呈现萌发率降低、主根较短的生长表型;而过量表达株系ARPK1OE#1和ARPK1OE#2的萌发率显著升高,主根较长;互补株系ARPK1-com则与Col-0无明显差异。在没有外源ABA施加的情况下,各株系的种子萌发和根的生长均无明显差异。说明ARPK1的表达水平能够影响种子萌发和幼苗根长对ABA的敏感性。2.通过使用DAB(3,3’-Diaminobenzidine)和NBT(Nitrotetrazolium blue chloride)对根尖进行染色,我们发现外源ABA处理后,arpk1-1和arpk1-2的根尖染色较Col-0显著加深,说明ABA处理能够诱导ROS在arpk1-1和arpk1-2的根尖中大量积累。3.通过对ARPK1基因启动子驱动的GUS转基因株系染色和qRT-PCR的检测和分析,发现ARPK1的表达受到ABA、氯化钠(NaCl)和甘露醇(mannitol)的显著诱导。4.在外源氯化钠、甘露醇、葡萄糖(glucose)等非生物胁迫处理下,arpk1-1和arpk1-2的种子萌发率和幼苗主根长度均低于Col-0。相反,ARPK1OE#1和ARPK1OE#2的种子萌发率和幼苗主根长度均高于和长于Col-0。ARPK1-com则与Col-0的生长表型无明显差异。这些结果表明ARPK1表达水平的变化能够影响种子萌发和幼苗根长对ABA相关的非生物胁迫的敏感性。5.在氯化钠处理下,arpk1-1和arpk1-2的根尖DAB、NBT染色均明显加深,而ARPK1OE#1和ARPK1OE#2的根的染色却较浅。说明ARPK1的过量表达可以降低高盐胁迫下根中ROS的水平,反之,ARPK1的缺失则可以促进高盐胁迫下ROS的过量积累。在甘露醇和葡萄糖的处理下,arpk1-1和arpk1-2的根尖颜色被NBT显著加深,说明ARPK1的缺失可以促进甘露醇和葡萄糖诱导根中超氧根离子的水平。6.将质粒pBI101-pARPK1-GUS转入abi4缺失突变体,通过分析GUS表达模式,发现ABA诱导的ARPK1-GUS的表达在abi4中被抑制。qRT-PCR也证实,经过ABA处理之后,Col-0中ARPK1的表达水平显著上升,而abi4突变体中ARPK1的表达水平并没有显著上升。这些结果说明ABA诱导的ARPK1的表达依赖于ABI4。7.通过杂交获得了abi4/arpk1双缺突变体,在abi4突变体背景下过量表达ARPK1获得了株系abi4/ARPK1OE,在arpk1突变体背景下过量表达ABI4获得了株系ABI4OE/arpk1,同时也构建了ABI4/ARPK1双过量表达的株系。表型观察发现,无论是种子萌发、幼苗生长还是根中ROS的水平,在ABA处理的情况下,与Col-0相比较,abi4,abi4/arpk1,abi4/ARPK1OE和ARPK1OE这四种类型的株系都呈现出对ABA敏感性减弱的表型;相反,arpk1,ABI4OE,ABI4OE/arpk1和ABI4/ARPK1则呈现出对ABA敏感的表型。高盐胁迫下观察到了与ABA相似的种子萌发和幼苗主根伸长的表型。
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