牛流行热（bovine ephemeral fever,BEF）是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）感染引起的一种急性传染病,主要造成牛突然高热（40℃以上）、呼吸急迫、僵硬、跛行等症状。其发病率高,感染性强,病死率低,由于疾病感染后会导致牛死亡及生产性能的降低,爆发后通常会带来十分严重的经济损失。牛流行热主要通过疫苗进行防控,没有特效药可以治疗,而疫苗研发技术还有待提高。对于BEFV的血清学检测,到目前为止,微量血清中和试验仍然是国际上检测BEFV的金标准,其余方法用于批量检测均还不够理想,因此还未能够扩大使用。微量中和试验操作难度要求大,耗时长,不适合田间检测。因此,加强对新技术的研究,开发新疫苗,减少免疫时间、免疫剂量,增加免疫保护时间以及研制稳定可靠的检测技术对牛流行热的综合防控是非常必要的。针对BEF的现状,本研究通过采集临床病料,分离病毒株,并建立便捷、特异性好、敏感性高的G1基因间接ELISA检测方法。本研究首先从广东某疑似感染牛流行热的牛群中采集牛抗凝血,通过PCR测序鉴定并对BEFV G基因序列进行遗传进化分析及同源性分析,发现目前中国大陆流行的牛流性热毒株都同属于一个大分支,该毒株与国内近期流行的毒株相比,其与甘肃近期流行的JT02毒株同源性最高,同源性达到97.6%,与国内疫苗株JB76H关系较远。本毒株与中国台湾、土耳其等地区流行的毒株亲缘性较近,与澳大利亚流行毒株的亲缘性较远,与目前世界流行毒株G基因序列的同源性在89.9%～97.9%之间。通过乳鼠脑内进行传代并经PCR鉴定,获得了鼠脑适应毒株。然后将鼠脑悬液感染BHK-21细胞,将感染细胞制作切片,在透射电镜下观察到子弹状的病毒颗粒,表明获得了牛流行热细胞适应毒株,该毒株病毒滴度为10-4.75TCID50/100μL。本研究分离并能稳定传代的细胞毒株1株,可为我国BEFV毒种进行补充,为进一步研究新疫苗奠定良好的基础。本研究利用p MAL-c5x原核表达载体,成功构建了原核表达质粒p MAL-c5x-G1,其在27℃,IPTG的终浓度为0.2 m M的条件下诱导6 h后,成功表达出了可溶性的G1、MBP标签和His标签的重组蛋白。采用GE公司的His填料对重组蛋白进行镍柱法纯化。纯化后的重组蛋白经过Western Blot验证,标签蛋白及G1蛋白都成功表达,表明蛋白具有良好的抗原性,为进一步建立间接ELISA方法奠定了良好的基础。利用矩阵滴定法对抗原包被浓度及血清稀释度进行了优化,根据阳性血清OD450nm的值在1.0左右、P/N的值最大且背景值较低的原则进行优化。最终确定以包被抗原G1浓度为25 ng/100μL、血清稀释度为1:25、酶标二抗稀释度为1:10000且封闭液为5%脱脂奶粉时条件最优。利用该方法对6份血清进行不同批次和相同批次的ELISA板进行重复性试验。结果显示,该批血清的批间变异系数在6.18%～11.9%之间,批内变异系数在3.07%～9.06%之间,表明该方法有较好的稳定性。对经微量中和试验验证的牛血清进行检验,测定其OD450 nm结果并用Med Calc软件分析ROC曲线,结果显示,该方法临界值为0.347,敏感性为96%,特异性为92%,表明该方法有较好的敏感性和特异性。本研究建立了牛流行热病毒抗体检测的ELISA方法,该方法具有较好的敏感性、特异性及稳定性,且包被的抗原量少,大大减少了成本。该方法操作便捷,具备生物安全性,适合工业化推广及使用,有望成为BEFV血清中和抗体检测的标准方法。