【摘 要】
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I群禽腺病毒属于腺病毒科,禽腺病毒属,根据限制性内切酶图谱和分子标准可将I群禽腺病毒分为5个亚群(FAdV-A~FAdV-E),根据血清交叉中和实验又可划分为12个血清型(FAdV-1~FAdV-8a,FAdV-8b~FAdV-11)。I群禽腺病毒所有12个血清型均可造成包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)。目前研究发现只有属于C亚群的禽腺病毒血清4型(FAdV-
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I群禽腺病毒属于腺病毒科,禽腺病毒属,根据限制性内切酶图谱和分子标准可将I群禽腺病毒分为5个亚群(FAdV-A~FAdV-E),根据血清交叉中和实验又可划分为12个血清型(FAdV-1~FAdV-8a,FAdV-8b~FAdV-11)。I群禽腺病毒所有12个血清型均可造成包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)。目前研究发现只有属于C亚群的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)能够造成心包积液肝炎综合征(hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS)。该病目前在全世界范围内流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。本研究从HHS发病鸡的肝脏样品中分离到一株I群禽腺病毒,通过鸡胚肝细胞(CEL)进行繁殖,之后将收获的病毒在鸡肝癌细胞(LMH)上成功的繁殖。并利用该细胞系进行蚀斑纯化实验,对病毒进行了纯化。高通量测序方法获得该病毒的全基因组序列,命名该株病毒为GX-1。全长43721 bp,包含了38个开放阅读框,其中G+C含量为54.87%,Gen Bank上收录号为MH454598。根据全基因组序列进行系统进化树分析,结果表明GX-1属于I群禽腺病毒C亚群、血清4型,基因组序列全长比对其他9株中国分离到的FAdV-4序列相似性为99%到100%,与印度分离到的B1株和墨西哥分离到的MX-SHP95也有98%到99%相似性,用hexon基因进行系统进化树分析也得到相同结果。透射电镜观察确定病毒粒子为大小60~90 nm的正二十面体。血凝实验发现该株病毒对鸡血没有血凝性。理化实验可知该株病毒高温耐受力强,能够抵抗弱酸,乙醚、氯仿等有机溶剂不能使其丧失活性。紫外线照射和甲醛溶液处理可使病毒灭活。为探索FAdV-4 GX-1株对SPF鸡、SPF鸡胚的致病性。用0.2 m L×103TCID50FAdV-4 GX-1病毒液对8日龄鸡胚进行接种,6 d内所有鸡胚死亡率为100%,与对照组比较,攻毒鸡胚发育迟缓,体型明显小于对照组胚体大小。SPF鸡致病性实验使用不同剂量病毒对10日龄SPF鸡攻毒。使用0.2 m L×104 TCID50剂量攻毒后在2dpi(day post infection,dpi)到4 dpi死亡率为100%,使用0.2 m L×103 TCID50剂量攻毒后9 dpi内死亡率为84%,使用0.2 m L×102 TCID50剂量攻毒后6 dpi的死亡率为20%。剖检发现病鸡肝脏肿大,表面出现点状出血和坏死灶和严重的心包积液、肾脏充血肿大。病理学检查发现心脏肌肉纤维断裂,并伴随有大范围的充血和出血。肝脏出现嗜酸性的核内包涵体,肝细胞多处凝固性坏死和水肿变性。肾脏水肿并伴随着肾小管变性和坏死。法氏囊淋巴细胞变性坏死,胸腺内皮细胞变性和坏死与淋巴细胞减少。脾脏中有少量的淋巴细胞变性和内皮细胞坏死。甲醛灭活方法制备了GX-1株的灭活疫苗,并进行了动物免疫保护实验,结果表明,GX-1株灭活疫苗在10日龄和24日龄分别对25只SPF鸡进行1次免疫和2次免疫,分别在结束免疫后第14 d攻毒剂量为0.4 m L×102 TCID50 FAdV-4 GX-1病毒液。结果表明次免疫后的第14 d检测到了FAdV的特异性抗体,1免组在接种疫苗后第35 d左右抗体水平达到峰值,而2免组抗体水平在接种疫苗第42 d左右达到峰值,攻毒对照组死亡率达100%,1免组能够获得90%的保护率,而2免组能获得100%的保护率。通过泄殖腔拭子检测病毒得知该灭活疫苗能有效阻止排毒。通过全基因序列分析和致病性研究,我们可以得出结论,本实验分离纯化的GX-1株属于I群禽腺病毒血清4型,基因组全长43721 bp,通过甲醛灭活方法制备的GX-1株灭活疫苗免疫10日龄SPF鸡,可以提供90%~100%保护率,并有效阻止排毒。可以为以后开发商业用疫苗提供参考。
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