世界性的人口老龄化问题明确地是指全球总人口数量中,年轻人口比重减少,而年长人口比重增大从而造成年长老年群体比例相应大幅度上升所带来的诸多社会性问题与矛盾。这是在上世纪八十年代世界卫生组织经过全球人口结构调查所发现的。据欧美等发达国家人口普查的研究来看,世界性的人口老龄化在历史演变过程中是从未出现的一种社会现象。在某些现代社会学家的研究看来,它是一种历史进步的标志。从根本上来讲,这种人口结构的转变是社会经济发展、教育水平提高以及医疗进步所带来的成就,也是克服传染性疾病、克服营养不良、保证饮用水安全以及降低母婴死亡率等公卫事业良好发展的必然结果。即便如此,根据目前的调查数据,到2015年,我国大陆地区60岁以上的老年人口将到达2.43亿,占大陆总人口的15.2%；预计到2020年,这一比例将会高达19%。按照国家卫计委统计审核惯例,65岁以上人口比例超过总人口的7%,就被称为老龄化社会。显然我国已经进入了老龄化社会。根据全国第六次人口普查的数据显示,我国共有26个省份和直辖市已经步入老龄化社会阶段。据专家推测,“十二五”末期,上述省份老年人口还将以超过3%的速度进行增长。这意味着,我国的老龄化进程还在进一步加剧,接踵而来的诸多如老年人群体医疗、康复、护理以及公共卫生服务等问题将会显得日益突出和严重。目前全社会均在提倡宣传健康老年化,促进老年人群健康与改善老龄阶段的生活质量是广大医护工作者和全社会各行业参与者的共同使命。美国老年医学会(American Geriatrics Society, AGS)在2013年科学年会中明确指出：“机体衰老造成相关功能的丧失是由机体本身生理机能障碍所引起,通过内科的相应治疗很大程度上是可以改善这些生理功能的障碍”。理论上延缓和改变衰老时触发的分子生物和生化等环节的变化,改变衰老相关生理状况,提高对衰老相关失调状况的耐受性,那么老年人群的生活质量就可以提高,人类寿命就可以延长。探寻机体衰老的相关分子靶点并进行切实有效地干预就成为当前研究的热点与焦点。随着全球化的老年人口迅猛增长,我国与欧美等发达国家的老年相关性疾病如脑卒中、冠心病、高血压、糖尿病等等的发展趋势也都在集中动态演变。而以动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)为主要病理生理特征的心脑血管疾病尤为突出,其发病率、病死率和致残率正逐步上升,其中之一的重要因素就在于当前社会人口老龄化的现象日益严重,随着年龄的增长,心脑血管疾病患病率持续升高,因而针对AS发病机制及防治策略的研究就显得格外重要。引发AS的主要危险因素包括有肥胖、高血压、高胆固醇血症、糖尿病、吸烟、年龄等。由于社会老龄化问题的日益突出,从而将年龄在AS发病机制中所发挥的关键角色进行研究已开始受到广泛关注,并逐渐成为干预与治疗AS的新靶点。通过流行病学的研究发现,伴随年龄的增长,AS的发病率会急剧增高。这其中主要的原因在于血管随着整个机体都在进行相应地老化,主要表现为血管结构与血管构成细胞的功能衰退,血管逐渐丧失原有机能,导致动脉顺应性下降、管腔扩大而弹性回缩能力减退,血管壁基质成分的改变。因此单列于动脉粥样硬化之外的这些血管衰老改变更进一步地促进了心血管病变部位的病理生理演变,从而在一定程度上增加了老年人群患心血管疾病的风险性,也加重了患病后的严重程度,妨碍了患者的预后恢复程度。当前在社会人口结构正逐渐向老龄化过度的背景下,防治AS则显得更加关键。如何去阐明年龄增长会给血管带来如此繁多的变化,血管组成细胞为什么会发生衰老,隐藏在血管衰老背后的细胞与分子生物学机制究竟是什么?这些都需要通过进一步研究来逐一解答。作为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMG-CoA reductase)的选择性抑制剂,阿托伐他汀通过抑制]HMG-CoA还原酶在肝脏与胆固醇的生物合成,从而降低血浆胆固醇和脂蛋白的水平,达到调节血脂的作用。此外在具有糖尿病、症状性动脉粥样硬化性疾病等冠心病危险因素合并血脂异常水平的患者中,可以降低非致死性心肌梗死的风险,降低脑卒中和血管重建术的风险,从而达到防治心脑血管相关疾病的作用。在以往的动物体内或者离体细胞研究中,针对血管功能障碍的干预方式主要是实施强加干预导致急性血管功能障碍为主的研究模型。而这样的研究模型显然不能很好地模拟生物机体衰老这一缓慢渐进的发生发展过程,因此建立自然衰老的体外与体内模型是我们亟需有待解决的关键问题。目前的研究发现,阿托伐他汀除了降低血脂的作用以外,还有其他心血管系统的保护作用。这些多效性的作用在血管壁结构中发挥其保护功能主要归结于抗氧化、抗炎症以及通过促进一氧化氮(Nitric oxide, NO)的生物活性改善血管内皮功能等等。在小鼠的心肌梗死模型中,阿托伐他汀能够促进心肌中新生血管的形成。而在细胞与分子水平,阿托伐他汀能够激活内皮型一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase, eNOS)并增加NO的生成。而在以往急性的血管应激损伤模型中发现,一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的另一种同形异构体,诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric oxide synthase, iNOS)的表达上调,而促进血管调节舒张的NO生成下降。因此推测eNOS/iNOS-NO在维系血管正常功能的状态下发挥着非常重要的作用。而在缓慢的血管衰老模型中又将会是怎样的一种情况,则需要更加深入的进行研究。根据报道,有很多的信号通路参与了在衰老过程中的信息调控。这些通路中的很多单独组件,通过基因控制被证实了而作为药物开发的靶点。沉默信息调节因子1(Silent Information Regulator 1, SIRT1)就是其中一个靶点。基于研究发现,SIRT1的位置在能量感应和调控应激耐受等信号通路的十字路口,而将其编码基因称为“长寿基因”。在能量限制(Calorie restriction, CR)期间,它可能会更好地调控寿命。因此有学者通过饥饿、营养胁迫和高脂饮食等方式来激发SIRT1活性的表达。那么在自然衰老的情况下,SIRT1究竟对血管老化以及细胞衰老有什么样的作用呢?SIRT1与NOS-NO系统有无相关的联系呢?基于上述的研究背景,我们设想自然衰老过程会相应引起血管组织及血管细胞的衰老,随着年龄增长而伴随着氧化应激以及NOS系统失调的情况,容易发展到AS阶段；阿托伐他汀可能延缓衰老的进展；SIRT1在这一过程中能够被激活与NOS-NO系统相互作用从而发挥保护血管及血管细胞的作用。本研究以自然衰老模型为代表,做以下三个环节的研究。一、自然倍增诱导血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)衰老及阿托伐他汀干预作用研究首先根据前期课题组在老年鼠分离培养胸主动脉血管平滑肌细胞的实验基础上,采用改进体外培养传代复制性衰老的方式,获得体外细胞培养模拟细胞衰老模型。实验细胞依据群体倍增水平(population doubling level, PDL)分4组：青年组(6PDL),中年组(14PDL),老年组(24PDL),老年药物组(于中年组时期细胞培养液中开始定量添加阿托伐他汀溶解药物直至老年组时期,剂量为10μmol/L)。按照药物和各组干预时间终点后,采用免疫组织化学染色法观察衰老相关p-半乳糖苷酶的活性,采用CCK-8法与流式细胞术检测细胞周期来观察细胞增殖能力。采用JC-1与TUNEL法检测细胞凋亡情况。然后观察细胞氧化应激损伤指标：丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性及NOS系统相关指标(NO的总含量,NOS活性)的变化。Real-time PCR测定NOS系统(eNOS与iNOS) mRNA的含量,免疫印迹法测定eNOS与iNOS的蛋白表达,免疫荧光法观察eNOS与iNOS的细胞定位及表达情况。结果表明：(1)随着细胞传代的延续,VSMC出现衰老表型(F=156.751,P<0.001),与青年组、中年组比较,老年组SA-β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比和细胞周期检测G0/G1期细胞比例明显增加(P<0.05)。(2)细胞内MDA含量增加(F=38.640,P<0.001),SOD活性下降(F=191.888,P<0.001),表明体外培养传代模型成功诱导VSMC衰老,提示氧化应激是血管平滑肌细胞衰老的重要机制。NO含量降低(F=28.736,P<0.001),钙依赖性NOS活性随细胞传代次数增加而下降(F=67.070,P<0.001),非钙依赖性NOS活性增加(F=67.070,P<0.001)。随传代次数的逐渐增加,eNOS的表达下降(F=187.907,P<0.001),而iNOS的表达升高(F=329.748,P<0.001),eNOS/iNOS的比值逐渐下降,提示NOS系统失调也是血管细胞衰老的重要机制之一。(3)与老年组比较,老年药物组通过较长时期的阿托伐他汀干预后SOD的活性增加(P<0.05),MDA含量减少(P<0.05),提高了NO的含量以及钙依赖性NOS活性(P<0.05),降低了非钙依赖性NOS的活性(P<0.05)。免疫荧光发现NOS系统表达于细胞质,随着传代次数的递增,而eNOS的荧光强度逐渐下降,iNOS的荧光强度逐渐升高,老年药物组能抑制iNOS的表达并通过增力eNOS的表达而使得失衡的NOS系统趋于平衡。二、自然增龄诱导大鼠主动脉血管衰老及阿托伐他汀干预作用为进一步探讨氧化应激与NOS系统失衡在血管衰老中的作用,我们又从自然衰老动物模型的角度观察了增龄过程中主动脉血管的变化情况以及阿托伐他汀干预后的相应影响。实验分为四组：青年鼠组(2月龄,n=8),中年鼠组(12月龄,n=8),老年鼠组(20月龄,n=8),老年鼠药物组(从12月龄开始添加含有阿托伐他汀的复合饲料喂养至20月龄,n=8,剂量为5mg/kg·d)。依照各组的干预终点,开胸取胸主动脉,检测血管环张力变化；运用免疫组化染色法观察衰老相关β-半乳糖苷酶的活性；观察细胞氧化应激相关指标：MDA的含量与SOD的活性；针对NOS系统相关指标来检测NO总含量和NOS的活性。Real-timePCR测定eNOS与iNOS mRNA的含量,免疫印迹法测定eNOS与iNOS的蛋白表达,免疫组织化学法观察eNOS与iNOS的表达情况。结果表明：(1)随着增龄改变,内皮依赖的血管舒张功能显著下降(F=70.346,P<0.001),非内皮依赖的舒张功能也有下降趋势。阿托伐他汀干预后可以改善血管舒张功能(P<0.05)。(2)伴随年龄增长,与青年鼠组和中年鼠组比较,老年鼠组SA-β-半乳糖苷酶染色的阳性细胞光密度值增加(F=79.486,P<0.001)。(3)主动脉标本中,老年鼠组MDA含量增加(F=132.420,P<0.001),SOD活性下降(F=241.340,P<0.001),表明活体组织增龄改变成功诱导主动脉血管衰老,提示氧化应激是血管老化的重要机制之一。NO的含量降低(F=27.208,P<0.001),钙依赖性NOS活性随年龄增长而下降(F=86.555,P<0.001),非钙依赖性NOS活性增加(F=86.555,P<0.001)。随年龄的逐渐增长,eNOS的表达下降(F=141.618,P<0.001),而iNOS的表达升高(t=-10.903,P<0.001),eNOS/iNOS的比值逐渐下降,提示NOS系统失调也是血管衰老的重要机制之一。(4)与老年鼠组比较,老年鼠药物组通过阿托伐他汀长期干预后SOD的活性增加(P<0.05),MDA的含量减少(P<0.05),并且提高了NO的含量以及钙依赖性NOS活性(P<0.05),降低了非钙依赖性NOS的活性(P<0.01)。免疫组化发现随着年龄的递增,eNOS的表达逐渐下降,而iNOS在老年组表达最高,阿托伐他汀干预后能抑制老年鼠药物组iNOS的表达并通过增加eNOS的表达而使得失衡的NOS系统趋于平衡。三、SIRT1在大鼠胸主动脉血管和平滑肌细胞衰老中的作用及阿托伐他汀的干预机制为进一步探讨SIRT1在自然衰老模型中发挥的作用以及阿托伐他汀的干预影响,我们分别对各组主动脉血管组织和血管平滑肌细胞中的SIRT1表达进行了检测。1、在血管平滑肌细胞中,运用Real-time定量PCR法测定SIRT1 mRNA的含量,免疫印迹法检钡SIRT1的蛋白表达,免疫荧光法定位SIRT1在细胞中的表达区域与情况。结果提示：(1)SIRT1主要表达于细胞核内,随着细胞传代衰老(F=267.107,P<0.001),老年组SIRT1的表达明显低于中年组(P<0.05)和青年鼠组(P<0.05)。而通过阿托伐他汀的干预后,与老年鼠组比较,老年鼠药物组SIRT1的表达上调(P<0.05)。(2)血管平滑肌细胞中SIRT1与NOS系统的相关性分析显示：SIRT1的表达与eNOS呈正相关关系(r=0.919,P<0.001),与iNOS呈负相关关系(r=-0.988,P<0.01)。而SIRT1与NOS系统的比值也呈正相关关系(r=0.932,P<0.01)。2、在主动脉血管中,运用Real-time定量PCR法测定SIRTlmRNA的含量,免疫印迹法检测SIRT1蛋白的表达,免疫组化法定位SIRT1在主动脉中的表达区域与情况。结果提示：(1)随着主动脉增龄衰老(F=168.199,P<0.001),老年组SIRT1的表达明显低于中年组(P<0.05)和青年组(P<0.05)。而通过阿托伐他汀的干预后,与老年组比较,老年药物组SIRT1的表达上调(P<0.05)。(2)主动脉中SIRT1与NOS系统的相关性分析显示：SIRT1的表达与eNOS呈正相关关系(r=0.975,P<0.001),与iNOS呈负相关关系(r=-0.972,P＜0.001)。而SIRT1与NOS系统的比值也呈正相关关系(r=0.989,P<0.001)。通过以上针对体内主动脉血管组织及体外血管平滑肌细胞的衰老模型研究,可以推断eNOS/iNOS的比值与SIRT1存在正相关关系。结论：通过本研究,我们能够得出以下结论：1、通过体外传代模拟细胞自然衰老,会出现氧化应激程度加重与NOS系统失调。这些提示细胞衰老会增加胞内氧化应激损伤的情况,在下调eNOS表达的同时,会上调iNOS,继而造成NOS系统比值的平衡失调。2、通过自然增龄模拟体内主动脉衰老,造成血管舒张功能出现障碍。这提示伴随衰老会加重血管中氧化应激程度,加重NOS系统的失调,减少NO在老龄鼠主动脉中的生物利用度,血管舒张功能发生改变。3、在体内及体外实验中进行长期阿托伐他汀的干预,既可以在细胞中减轻氧化应激带来的损伤,恢复NOS系统的平衡,又可以在主动脉血管中提高NO的生物利用度,改善血管的舒张功能。4、血管组织老化与血管平滑肌细胞衰老过程中,SIRT1的表达逐渐下调,与NOS系统的平衡失调有关。阿托伐他汀可通过上调SIRT1的表达,并维系eNOS/iNOS的平衡,从而达到保护血管延缓血管衰老的目的。