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双酚A(Bisphenol A, BPA)化学结构与β-雌二醇结构类似,是已经证实的一种环境雌激素活性物质。BPA主要用于塑料的聚碳酸酯、环氧树脂制造以及其他塑料聚合物添加剂的制造,其广泛的应用导致人类无时无刻不在接触BPA。BPA在生产过程中的不完全聚合,以及生活中大量相关产品的不断降解,导致其释放到环境、食品、饮料等介质中,大量的监测研究表明人类普遍暴露在具有生物活性水平的BPA中。本实验室在研究中发现1nM(0.228μg/L) BPA对F1、F2代斑马鱼产生雄性主导的显著生殖毒性,且BPA对F2代斑马鱼的毒性效应大于F1代。为了研究BPA多个世代慢性暴露对斑马鱼生殖毒性影响的趋势,本文以F2代暴露斑马鱼为实验材料持续进行世代暴露,以此研究1nMBPA对F3、F4代斑马鱼生殖毒性的影响及毒性趋势。 每一世代均采用0或1 nMBPA从胚胎早期受精后8h水体暴露至受精后发育150天,F3代群体的获得来自于其亲本F2代所产胚胎,F4代群体的获得来自于其亲本F3代所产胚胎。研究中分别对F3、F4代成年斑马鱼的生殖毒性以及其子一代幼体的遗传毒性进行评价。对成年斑马鱼生殖毒性的检测指标包括:性别比例,150dpf丰满度与生殖腺发育,以及精子密度、精子活力、精子泳动速度、精子ATP水平与脂质氧化等精子质量评价指标。子一代幼体的发育毒性检测指标包括孵化率、畸形率、死亡率的统计。另外结合RT-PCR以及Q-PCR分子生物学技术检测150dpf雄鱼精巢发育相关基因表达情况等。 本文研究结果表明: (1)暴露过程观察发现,1 nMBPA暴露对F3、F4代斑马鱼摄食量没有任何影响,且对斑马鱼存活率、生长发育基本没有影响。斑马鱼性成熟后统计性别比例,发现BPA暴露导致F3、F4代群体雌性化。研究中发现,BPA暴露导致精巢抗苗勒氏管激素(amk)表达显著下调和生殖系α因子(figa)表达显著上调,并导致雄鱼血清睾酮水平的下降与雌二醇水平的升高,由此可能诱导了雌性化。 (2)精子活力检测结果表明,BPA暴露导致F3、F4代精子密度下降,显著降低精子总活力、活跃精子活力、精子泳动速度。同时,研究发现BPA暴露导致精子ATP水平下降,并导致精子产生脂质氧化与活性氧。由此可见,BPA诱导精子细胞产生氧化应激与活性氧,降低了线粒体的膜电位,扰乱了ATP的产生,从而造成精子活力及精子泳动速度的降低。 (3)研究发现BPA暴露对F3、F4代亲本产卵量、受精率没有影响,但是BPA暴露导致其子一代48hpf孵化率显著下降,畸形率虽升高但没有显著性,尤其F4代子一代畸形率、死亡率同对照组相比基本没有差别。由此来看,BPA暴露导致子一代的高畸形率、高死亡率只出现在F2代的子一代群体中。 总体来看BPA暴露至第四代,斑马鱼出现适应性的表型变化,表现为:F4代群体BPA暴露四代组别B4与BPA暴露三代组别B3B0相比,性别比例、精子质量、受精率等亲代表型,以及孵化率、畸形率等子一代表型基本没有差别;与前三代相比,BPA暴露对F4代的子一代群体孵化率、畸形率、死亡率的影响大大降低。另外,F3、F4代精巢非典型WNT信号通路相关基因及适应性基因表达水平分析结果,也证明了这种适应性的产生。总之,随着BPA多代暴露的持续,生殖毒性并不是呈加剧趋势,暴露至第四代斑马鱼出现适应性。研究推测,BPA暴露多代已改变精子表观基因组,F4代个体从上一代获得抗性基因,又将这种抗性基因通过生殖细胞传递到其子一代。由此可见,生物种群长期慢性暴露在压力环境中可产生一种能力去适应这些压力,但相关机制需要进一步深入研究。