关节骨软骨损伤自身难以修复,临床上常用骨软骨联合移植修复。但是自体移植可造成附加损伤且来源有限,异体移植存在免疫排斥反应和疾病传播的问题,而常用的组织工程方法需分别构建骨和软骨组织工程修复体,经体外生物反应器培养和骨软骨相的连接等步骤,过程繁琐、使用不便。本研究通过应用“体内生物反应器”理论,构建一体化的细胞支架复合体体内诱导修复关节骨软骨缺损。第一部分胶原/壳聚糖支架的构建目的:观察不同浓度、配比和不同冷冻温度对胶原/壳聚糖支架微观结构、力学性能的影响。方法:通过酸解-酶解的方法制备鼠尾胶原,用SDS-PAGE测定分子量,紫外分光光度法测定其吸收峰及微量凯氏定氮法测定氮含量来对胶原产物进行定性和定量分析。采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架,按照冷冻温度,溶液浓度,胶原、壳聚糖比分成5组:A组-2O℃、2%、1:3;B组-8O℃、2%、1:3;C组-2O℃、1%、3:1;D组-2O℃、1%、1:3;E组-2O℃、2%、3:1。对其进行扫描电镜观察,生物力学测试。结果:通过酸解-酶解的方法制备的鼠尾胶原分子量约为97KD,在230nm处有紫外吸收峰,纯度约为96%。A组支架孔隙丰富,大小均一,交通孔丰富。B组支架孔隙呈近似平行带状,带状孔隙之间无明显交通孔。C、D组支架呈絮状。E组支架部分呈片层状。A、C、D、E孔径大小无明显差异。A组支架生物力学测试优于其他组。结论:鼠尾胶原为纯度较高的Ⅰ型胶原,-2O℃预冻的2%浓度的胶原壳聚糖比为1:3的支架孔隙、强度较好,为本研究中较为合适的支架。第二部分京尼平交联胶原/壳聚糖支架的实验研究目的:通过比较材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率,探讨交联方式、交联剂浓度、交联温度、交联时间对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。方法:分别按照交联方式以及支架交联中交联剂浓度、交联温度、交联时间等影响因素分成10组,混合交联组分成A(0.1%,20℃,24h)、B(0.5%,20℃,24h)、C(1.0%,20℃,24h);支架交联组分成D(0.1%,20℃,24h)、E(0.5%,20℃,24h)、F(1.0%,20℃,24h)、G(0.5%,4℃,24h)、I(0.5%,36℃,24h)、J(0.5%,20℃,12h)、L(0.5%,20℃,72h)。以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照组X,评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率。结果:混合交联组ABC三组孔径依次为113.62±53.44μm、258.36±77.93μm、384.43±92.14μm,差异显著(P<0.01)。支架交联组中各组内孔径大小及溶胀率无显著差异,E组交联度为67.6%±3.6%,降解率为0.9%±5.9%,分别优于D、G、J组(P<0.01),而与F、I、L组无显著差异。交联各组的降解率和溶胀率均低于对照组X(P<0.01)。结论:京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率。支架交联组中交联剂浓度、交联温度、交联时间的增加均可增加交联度,降低降解率,其中E组条件即0.5%京尼平溶液于20℃下浸泡24h为本研究最适合的交联条件。第三部分交联胶原/壳聚糖支架的生物相容性研究目的:选择合适的种子细胞并评价支架的生物相容性及支架细胞复合体在体内的反应。方法:MTT实验测定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)和兔脂肪干细胞(ADSCs)于交联和未交联支架上的相对增殖率。扫描电镜观察兔脂肪干细胞(ADSC)于交联支架上的黏附状态。H&E染色光镜观察单纯支架以及双相接种的细胞支架复合物于兔股部肌袋的反应。结果:ADSCs相对增殖率优于BMSCs。扫描电镜观察在支架上少量黏附。2w,4w材料周围均无明显炎症反应。双相接种支架细胞复合物,细胞高密度均匀分布,4w时存活良好。结论:ADSCs为适合于本研究支架的种子细胞,支架材料生物相容性良好,双相接种为适合本研究的高效接种方式。第四部分分层支架的构建及复合BMP双相接种脂肪干细胞修复兔骨软骨缺损目的:构建一体化细胞支架复合体修复兔关节骨软骨缺损。方法:制备脱脂、脱蛋白松质骨载体,0.5%胶原杂化,在其上置约2mm厚2%胶原溶液,风干形成致密层,在其上灌注总浓度2%胶原/壳聚糖为1:3的溶液-20℃预冻后冻干,0.5%的京尼平溶液中室温下交联24h,制得分层支架,胶原凝胶负载BMP双相接种ADSCs于支架上,得到一体化细胞支架复合体。取新西兰兔16只,在股骨髌沟部造成直径4mm深达髓腔缺损,12膝植入细胞支架复合体,为实验组,12膝植入无细胞支架复合体,为对照组,剩余8膝为空白对照组。术后8w、12w取材,行大体及组织学观察、组织学评分。结果:8w:实验组缺损内填以白色半透明组织,表面不平,与正常软骨界限较清,组织学观察为类软骨组织,致密层未见明显降解,其余支架基本降解;对照组缺损未见修复,支架材料未见明显降解。12w:实验组缺损内填以白色透明组织,表面平整,与正常软骨界限不清。组织学观察为新生软骨,可见不同分层,软骨下骨连续,与软骨部连接紧密。整体材料基本降解。对照组缺损周围可见透明膜状组织覆盖,中央部仍为填充材料。组织切片观察,支架材料未见明显降解,材料表层周围为透明软骨覆盖,内部以肥大细胞为主。空白对照组缺损内形成的组织多为纤维瘢痕组织。组织学评分,8w、12w实验组均优于对照组和空白组(p<0.01),实验组12w时优于8w(p<0.01)。结论:应用“体内生物反应器”理论,使用一体化分层支架复合BMP双相接种ADSC的细胞支架复合体可以较好修复兔关节骨软骨缺损,是修复骨软骨缺损的较好方法。本研究充分应用“体内生物反应器”理论,不仅从支架成分上模拟细胞外基质,而且在支架设计上考虑体内环境氧分压,力学刺激等影响因素的作用,构建出高度仿生的一体化的细胞支架复合体。该一体化修复体在体内关节腔和骨髓腔的不同生理环境下分别向骨组织和软骨组织两方向分化,可以较好的修复骨软骨缺损。