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神经氨酸酶(NetJraminidase NA)是禽流感病毒(Avian influenza virus AIV)主要糖蛋白之一。本论文主要从以下几个方面对其进行研究：a、H5N1、H9N2亚型禽流感病毒NA基因的克隆与生物信息学分析；b、H5N1、H9N2亚型禽流感病毒NA蛋白球部区域高效可溶性表达；c、以所表达可溶性蛋白做包被抗原，建立鉴别诊断抗体ELISA方法。
首先，利用所设计两对引物NA1U、NA1D和NA2U、NA2D，采用RT-PCR技术分别从H5N1、H9N2亚型禽流感病毒中扩增出H5N1 NA1基因和H9N2 NA2基因，获得NA1和NA2基因全长，大小均为1410bp。克隆重组到pGEM-T Easy载体上构建T-NA1、T-NA2质粒，测序分析获得正确的序列。比对分析表明，NA1与NA2核苷酸同源性为53.8％，氨基酸同源性为41.5％。利用生物信息学，对其基于大肠杆菌表达系统的稀有密码子进行分析，发现NA1、NA2基因稀有密码子的比率分别为：6.6％、10％左右；对NA1、NA2氨基酸序列信号肽分析、跨膜区分析、二级结构预测以及在二级结构预测的基础上分析其氨基酸的亲水性、可及性、极性；最后综合分析抗原表位，其主要抗原位点以及活性中心都位于其球部区域，理论预测其应该有良好的免疫原性。
设计针对NA球部区域的两对引物GN1U和GN1D、GN2U和GN2D，分别从T-NA1、T-NA2上扩增出NA1、NA2基因的头部区域序列，大小分别为1137bp、1179bp，酶切后与本实验室构建的高效可溶性表达载体pBCX质粒重组构建重组质粒pBCX-GN1、pBCX-GN2质粒，转化大肠杆菌BL21(DE<,3>)，获得重组阳性菌pBCX-GN1-BL21、pBCX-GN2-BL21，诱导表达经SDS-PAGE检测，分别在77和78KDa大小左右获得目的蛋白，分别命名为GN1P、GN2P。分别以H5N1、H9N2亚型禽流感病毒标准阳性血清为一抗，对GN1P、GN2P蛋白Western-blot检测，各自获得一条清晰的目的带，说明所表达的蛋白具有免疫原性。可溶性分析，可溶性部分占70％左右。禽流感神经氨酸酶球部区域在大肠杆菌成功可溶性表达，有利于对其结构和功能进一步深入研究，有利于禽流感基因工程疫苗的研究，有利于开发无毒无害禽流感的防控和鉴别诊断试剂。
分别以GN1P、GN2P为包被抗原，初步研究了鉴别H5N1、H9N2亚型流感病毒抗体的ELISA方法的条件。蛋白GN1P、GN2P最佳包被浓度约为10μg/ml，标准阳性血清的稀释度为1：80，最佳封闭液为1％BSA，最佳封闭时间为2h，另外，本论文还对40份阳性血清检测，结果表明具有良好的特异性，对禽流感的防控和鉴别诊断有很大意义。