RNA沉默是真核生物中普遍存在的RNA诱导调节机制,不仅调控植物生长发育、对生物和非生物胁迫做出响应,还是重要的抗病毒防御机制。在前期研究中发现一条拟南芥DCL4介导、无需DRB4参与的抗芜菁皱缩病毒(Turnip crinkle virus,TCV)RNA沉默新途径,但其分子机制尚不明确。本研究采用分子生物学和遗传学相结合的方法研究AGO1和AGO2蛋白是否参与这条DCL4介导的抗病毒RNA沉默新途径并取得如下结果:(1)仅插入44 bp拟南芥八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)序列的基于TCV的病毒诱导沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)载体CPB-CC而构建的CPB1B和CPB1F能有效地沉默靶标基因,产生白化现象。(2)表型观察、RT-PCR检测及测序分析结果显示,VIGS载体CPB-CC病毒载体最大插入片段为不超过357 bp,但插入片段小于187 bp才能有效地沉默靶标基因,产生明显的白化现象。(3)qRT-PCR和Northern blot检测结果表明基于CPB1B构建的靶标DCL4基因的VIGS载体CPB1B-DCL4A、CPB1B-DCL4B不仅能同时沉默PDS和DCL4基因,并且拟南芥dcl2突变体的DCL4基因被沉默后TCV复制量明显增加,说明已建立利用VIGS载体CPB1B和拟南芥研究靶标基因是否参与抗TCV沉默途径的高效体系。(4)运用已建立的研究体系发现,拟南芥dcl2drb4突变体感染插入为GUS基因片段的TCV突变体CPB1BGUSA后AGO1和AGO2基因的表达量均被上调,初步表明AGO1和AGO2蛋白均可能参与DCL4介导的抗TCV沉默新途径;然而插入AGO1、AGO2 基因片段的 VIGS 载体 CPB1B-AGO1B、CPB1B-AGO1C、CPB1B-AGO2A、CPB1B-AG02B不仅能分别有效地沉默AGO1和AGO2基因,而且AGO1和AGO2基因被沉默后,病毒TCV的表达量均比感染CPB1BGUSA的对照高,进一步表明AGO1和AGO2蛋白都可能参与DCL4介导、无需DRB4参与的抗TCV沉默新途径。(5)通过T-DNA插入突变体杂交,获得AGO1、AGO2单独或同时被敲除的 dcl2drb4 纯合突变体 ago 1dcl2drb4、ago2dcl2drb4、ago1ago2dcl2drb4。用 VIGS载体CPBlB 感染后 ago 1 dcl2drb4、ago2dcl2drb4、ago1ago2dcl2drb4 及 dcl2drb4突变体均能发生白化现象,并且ago1ago2dcl2drb4突变体的白化程度明显减弱,仅发生在新长出叶片的主脉,但病毒症状最为严重。Northern杂交检测结果显示,agoldcl2drb4、ago2dcl2drb4、ago1ago2dcl2drb4中的病毒复制量明显比对照dcl2drb4突变体增加,并且ago1ago2dcl2drb4增加量最大,该结果不仅进一步证明AGO1和AGO2蛋白都参与DCL4介导,无需DRB4的抗TCV沉默新途径,并且除AGO1和AGO2蛋白外还有其它AGO蛋白的参与。本研究将有助于解析DCL4介导、无需DRB4参与的抗病毒RNA沉默新途径的分子机制,加深对病毒-寄主之间复杂的相互作用分子机制的认识,亦为探索更有效的病毒防治新策略提供理论依据。