现今，由于世界范围内人口爆发、能源枯竭、环境恶化，寻找可再生资源己成为世界各国迫在眉睫的课题。天然纤维素因其可再生、产量高、环境友好，被认为是解决粮食和能源短缺以及环境污染等问题的希望所在。目前，纤维素的微生物降解问题得到了越来越多的关注，但是国内外报道的纤维素酶均存在酶活性低、种类相对较少等问题，因此寻找和开发高活性、广底物以及适应极端环境的新型纤维素酶已成为纤维素酶开发和利用的首要问题。纤维素酶系中，β-葡萄糖苷酶用于水解纤维二糖和短链纤维素寡糖生成葡萄糖，是纤维素彻底降解的关键酶，因此开发研究新型高效的β-葡萄糖苷酶对于整个纤维素酶产业都具有十分重要的意义。　　 自然界中微生物种类繁多，但其中只有1-10％被人们所认识，开发利用明显不足。目前，国际上对微生物的研究己进入分子和基因水平，建立了一系列诸如宏基因组学的新研究途径。宏基因组学是指以环境中微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及与环境之间关系为研究目标的微生物研究方法。　　 本研究基于造纸黑液废水中存在的大量纤维素降解微生物以及β-葡萄糖苷酶的重要价值，采用宏基因组学研究手段，构建造纸黑液废水菌群的宏基因组文库，成功筛选得到一个新型的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因，并对该酶进行克隆、表达、纯化以及酶学性质研究。　　 本论文主要研究内容如下：　　 一、造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建和筛选　　 本研究从造纸黑液废水中提取微生物群体基因组DNA，然后送至华大基因公司构建宏基因组文库。文库DNA片段大小为6.0-8.0 kb，载体为pUC118，宿主为Escherichia coli DH5b。然后利用β-葡萄糖苷酶活性检测平板，从宏基因组文库中筛选得到一个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因，编号为pbgl25-217，全长为1428bp。其编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217共含有476个氨基酸，预计分子量(MW)为54798.73 Da，等电点(pD为5.14，是一种亲水性蛋白质。目前有关6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的研究较少，且Pbgl25-217与己报道6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列同源性较低，因此对pbgl25-217进行研究存在较高的理论价值。　　 二、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因pbgl25-217的克隆与表达　　 本研究从原始菌株25-217的质粒DNA上克隆得到6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因pbgl25-217，并插入到表达载体pETDuet-1中，得到重组质粒pbgl25-217-pETDuet。然后将重组质粒pbgl25-217-pETDuet转入表达宿主Escherichia coli Rosetta，最终成功异源表达出有活性的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbg125-217。　　 三、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的纯化与酶学性质研究　　 本研究利用菌株E.coli Rosetta(pbgl25-217-pETDuet)诱导表达Pbgl25-217，并使用亲和层析和阴离子交换层析技术纯化得到较高纯度的Pbgl25-217。初步研究Pbgl25-217的基本酶学性质，发现该酶最适温度为37℃，最适pH为7。该酶在低温下能保持较高的稳定性，随着温度升高其稳定性逐渐减弱；在pH8时稳定性最高，pH5-9时也能保持较高的稳定性。金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+对该酶活性基本没有影响；Ni2+、Fe2+对该酶活性有部分抑制作用；Zn2+、Cu2+、Fe3+对该酶活性则有很强的抑制作用。该酶Km值为4.80 mM，Vmax值为5187.04U· mg-1。　　 四、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的定点突变研究　　 本研究以6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因pbgl25-217为模板进行定点突变，并诱导表达得到E179A、E372A、Y311F、W420F、S427A、S427C、S427D、S427E、K435L、Y437F等10种突变蛋白。与Pbgl25-217相比，S427A、S427C酶活性基本未改变；W420F、S427D、S427E、Y437F酶活性降低很多；E179A、E372A、Y311F、K435L则完全丧失酶活性。