肠道病毒71型是一种嗜神经病原体,能够引起具有严重神经症状的手足口病。然而目前我们对肠道病毒71型感染的发病机制的认识,特别是传播方式和途径,了解的仍然有限;而且,当前国内还没有有效的预防方式和精准的治疗方法来应对EV71的爆发,从而使得EV71成为在东南亚地区最紧迫的公共健康问题。深入的研究EV71与宿主之间的相互作用,可以为我们寻找治疗手足口病的解决办法提供有意义的理论支撑。以前的研究表明在体外和体内实验中,EV71感染可以诱导自噬,增强病毒复制,但没有解决具体的机制问题。越来越多的证据也表明,自噬,以病毒特异性的方式,来帮助病毒复制。我们在研究中发现EV71可以通过调控mir-30a和PML,可以诱导自噬,为病毒的复制提供有力的条件。在这项研究的第一部分实验,首先我们报告EV71感染人类口腔癌上皮细胞（Hep2）和非洲绿猴肾上皮细胞（Vero）可以诱导自噬,这将有利于EV71病毒复制。我们研究的机制揭示EV71感染可以导致细胞内mir-30a的减少,而miR-30a可以抑制Beclin-1,Beclin-1是一种关键的自噬促进基因,在自噬体形成的早期起重要作用。同时我们提供了进一步的证据,通过过表达或抑制mir-30a来调节细胞内mir-30a水平,mir-30a可以靶向beclin-1,直接通过调节自噬活性分别抑制或促进EV71复制。在这项研究的第二部分实验的研究工作里,我们重点研究了宿主细胞内的PML可以通过抑制自噬的形成,从而负向调控EV71复制。PML（promyelocytic leukemiaprotein）,又叫早幼粒细胞白血病蛋白,是维持PML核体结构的骨架蛋白。PML的缺失在肿瘤细胞中可以诱导自噬的产生,可以为肿瘤细胞的生长提供有力的生长环境。通过抑制肿瘤细胞的自噬环境,提高肿瘤细胞进行放疗和化疗的效果。同时大量研究表明PML蛋白具有很广谱的抗病毒能力,尤其是在DNA病毒报道很多,而在RNA病毒方面的报道很少。目前,PML和PML核体与EV71的相互作用关系尚未有报道。一方面,PML蛋白在病毒入侵宿主细胞的早期起着拮抗病毒复制的作用;另一方面,PML基因受干扰素的调控,在干扰素的作用下,PML蛋白表达增加,抑制病毒复制的能力增强。PML蛋白和PML核体作为宿主细胞的限制性分子成为宿主细胞抗击外来微生物侵袭的天然免疫系统的重要组成之一。相应地,各种病毒也在自身进化的过程中,进化出各种机制来逃逸PML蛋白和PML核体的抗病毒活性。事实证明,许多病毒会“逃逸”宿主细胞的PML的攻击,从而帮助自身完成生命周期。最后,我们着重关注了 EV71编码的蛋白酶3C通过降解PML来破坏PML核体形成从而来逃逸PML在病毒感染中的抗病毒作用。本论文主要研究结果如下:1,在研究内容的第一部分:（1）我们确定了 mir-30a,通过调节EV71诱导的自噬而抑制EV71复制。同样重要的是,宿主细胞内mir-30a的下调促进EV71复制,表明这种microRNA在EV71诱导的自噬体形成中发挥重要作用。（2）首先EV71病毒感染Hep2和Vero后可以诱导自噬。为了进一步证实EV71感染确实诱导自噬,通过Western分析在Hep2和Vero细胞中确定自噬现象的存在,检测了自噬特异性蛋白标记物Beclin-1和LC3。（3）EV71感染下调了宿主细胞内mir-30a的水平。而mir-30a靶向抑制Beclin-1的表达。过表达mir-30a可以通过抑制自噬的过程从而抑制了 EV71病毒复制。为了进一步说明miR-30a对EV71复制的影响,用antag-mir-30a转染Hep2细胞来抑制miRNA-30a表达。抑制mir-30a可以促进EV71病毒的复制。2,在研究内容的第二部分:（1）我们首先采用了 siRNA技术,靶向下调PML,通过免疫印迹和QPCR方法检测,HeLa细胞里下调PML之后,再被EV71病毒感染;与siNC处理组相比,siPML处理组的EV71病毒复制显著增加。同时我们用PML完全敲除的细胞系PML-/-和野生型PML+/+相比较,EV71病毒在PML+/+细胞系里的复制能力明显增强。得到结论,确认了 PML在病毒复制的过程里所承担的抑制病毒复制的能力。（2）因为PML在mRNA水平的选择性剪切导致了 PML的不同亚型的形成。不同的亚型在病毒复制的过程中承担的角色也是不同的。我们在HeLa细胞过表达了六个不同亚型的PML质粒,分别被EV71病毒感染24小时以后,收集了病毒上清。并用TCID50的方法检测了每个PML亚型所对应的病毒上清。结果显示PMLⅢ和PMLⅣ过表达后显著抑制了子代EV71病毒的复制,而其它亚型PML（PMLⅠ,PMLⅡ,PMLⅤ,PMLⅥ）所对应的子代病毒的复制和对照组相比,并没有发生明显变化。（3）PML可以抑制自噬过程的发生,而EV71病毒的复制过程需要自噬的支撑。所以我们推测敲除PML后,在宿主细胞内诱导了一定的自噬水平,自噬的环境为EV71的复制提供了一个有利的环境促进了 EV71病毒的复制。我们比较了在表达了 GFP-LC3的HeLa PML+/+和HeLa PML-/-细胞里感染病毒组和未感染病毒组里自噬小体形成。感染24小时后,我们用免疫荧光实验观察到在感染组里自噬小体的形成在HeLa PML-/-里面高于HeLa PML+/+。我们也用免疫印迹实验检测了 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转变的比例,发现LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平在HeLa PML-/-里面高于HeLa PML+/+。（4）我们通过激光共聚焦的实验观察到EV71感染HeLa细胞的过程中细胞核内PML核体数目减少,甚至消失。通过免疫印迹实验检测HeLa细胞和293T细胞在EV71感染的过程中PML蛋白的表达;PML蛋白在病毒感染的过程中不断的被降解。同时在IFN-β预处理的HeLa和293T细胞后,PML表达水平上调后,被EV71病毒感染后,24小时后检测PML蛋白的表达水平。免疫印迹实验结果显示在IFN-β处理后HeLa细胞和293T细胞里,EV71感染后的PML蛋白水平下降,随着EV71感染MOI增加,PML蛋白的降解水平增加。（5）最后,我们研究了 PML在EV71病毒复制中降解的机制以及PML核体是如何被破坏的。利用蛋白酶体的抑制剂epoxomicin和MG132阻断蛋白酶体功能后,没有达到挽救由于EV71感染引起的PML的降解的命运,同时也没有拯救由于EV71感染引起的PML核体的破坏。所以我们推论PML的降解不依赖于蛋白酶体途径。（6）EV71病毒编码蛋白酶有2A和3C两种。PML的降解和PML核体的破坏是通过蛋白酶3C而不是蛋白酶2A。综合上述的结果,我们可以得出这样的结论,细胞内的诱导自噬环境的产生可以通过多种方式,包括调控mir-30a和PML。在EV71感染的过程中,其一可以通过调控mir-30a靶向自噬基因beclin-1的水平,从而促进病毒的复制;其二EV71病毒可以通过降解宿主蛋白PML的水平来诱导自噬水平的提高,从而促进病毒的复制。无论是从mir-30a方式还是宿主蛋白PML,两者都是EV71在进化过程中,通过不同作用方式来调控自噬水平,提供一个有利于病毒复制的环境。同时在抵御宿主天然免疫的过程中,病毒通过调控宿主细胞内的多种因素来达到创造一个有利于病毒自身增殖的条件。