研究背景:急性白血病（AL）是我国的十大恶性肿瘤之一,也是青少年发病率最高的恶性肿瘤。AL包括急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓细胞白血病（AML）。AL的发生是由于骨髓中异常的白血病细胞大量的增殖并不断侵犯机体各个器官、组织,使得正常造血功能受到抑制,从而引起临床常见的感染、出血、贫血等症状。AL一旦发生,病情危重,进展迅猛,死亡率高。近年来由于环境污染等因素,AL的发病率呈明显上升趋势。随着新的化疗药物的应用、化疗方案的改进、支持治疗的加强及造血干细胞移植技术的广泛应用,AL的治疗效果已有明显改善,75%左右的AML患者经化疗后可获完全缓解（CR）,但仍有20%～30%AL病人经常规化疗方案不能获得CR,称为难治性AL。此外,50%左右的CR病人还会出现复发。而一旦出现难治和复发,再次缓解率低,预后差。因此,难治和复发是目前导致AL治疗失败的最根本原因。目前所制定难治复发白血病的诊断标准均为临床治疗后的回顾性诊断,无法运用于指导临床分层治疗。如果能够建立起一套难治复发白血病早期诊断的方法,不仅可以早期预测难治复发,判断病人的预后;而且更重要的是能够指导临床治疗,对高危病人应改变常规的治疗模式,采用更积极的个体化治疗,如更早地选择异基因造血干细胞移植等,从而减少难治复发白血病发生率、提高AL治疗缓解率和长期生存率,具有十分重要的意义。目前研究发现某些基因的异常与白血病发生及发展（难治复发）存在密切关系,如AML的FLT3内部串联重复（FLT3/ITD）突变和ALL的bcr/abl融合基因的表达。目前已证实20%～30%AML和ALL病人分别存在FLT3/ITD突变和bcr/abl融合基因的表达,而具有FLT3/ITD突变AML和bcr/abl阳性ALL易出现难治复发,预后差,可作为早期诊断难治复发的分子指标,指导临床治疗。但70%～80%AML和ALL不存在FLT3/ITD突变和bcr/abl融合基因,且目前尚缺乏同时在ALL和AML均有异常表达并与预后相关的基因异常。因此,寻找新的与难治复发AL相关的基因异常用于指导临床分层治疗显得十分迫切。最新研究提示ERG基因及MN1基因在AL患者中过度表达,且可能与难治复发AL相关。ERG基因[V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog（avian）]位于21q22,是ETS癌基因家族的一员,ETS转录因子是系特异性的调节淋巴细胞定型、分化的关键分子,而ERG在调节淋巴细胞早期成熟过程中起重要作用。在早期T、B淋巴细胞和髓系细胞中都可检测到ERG特异性的表达。研究发现ERG过度表达常见于有复杂核型和21染色体异常的AML患者中,ERG基因在造血干细胞,原始巨核细胞系,唐氏综合症患者的白血病细胞内也可出现表达。ERG基因在细胞的增殖、分化和凋亡过程中起关键作用,目前发现ERG基因可以在AML与ALL患者均可出现异常表达并可能与预后相关。MN1基因[meningioma（disrupted in balanced translocation）1]起初被发现是脑膜瘤患者t（4;22）的一个靶基因,尽管MN1与脑膜瘤之间的关系仍然未明,但是它被认为是22染色体上主要的脑膜瘤肿瘤抑制基因。研究发现MN1可在原始造血细胞及ALL患者中出现异常高表达,提示MN1在白血病形成过程中起重要作用。文献报道MN1是造血过程中独立的致癌基因,可能通过促进增殖及抑制分化而诱发白血病。目前发现大多数AML及ALL患者均可以发现MN1基因的异常表达,但不同AL患者中其表达水平存在较大差异。国外最新研究发现,MN1的过度表达是AML独立的预后因素。MN1高表达者其诱导缓解疗程第15天对化疗的反应显著差于低表达组,且其无复发生存率（RFS）和总生存时间（OS）也明显缩短。目前发现MN1和ERG基因的表达水平与AL的预后存在一定关系,且考虑到两者在AL发生、发展中的作用及其在不同AL患者中的表达水平的差异。有必要深入研究MN1和ERG基因在AL（包括ALL和AML）患者中的表达水平、明确两者的相关性及其与临床疗效和预后的关系,探讨联合定量检测MN1和ERG基因的表达水平在早期诊断难治AL及预后判断中的价值。在本研究中,我们构建了实时荧光定量PCR检测ERG和MN1基因mRNA表达量的方法,并检测87例初发AML患者、80例初发ALL患者及16例非恶性血液病者ERG和MN1 mRNA的表达水平,并对其与细胞形态学,细胞遗传学,免疫表型、临床特征、临床疗效及预后的关系进行了分析。目的:1、构建实时荧光定量PCR检测ERG和MN1基因的方法;2、检测初治AL患者（包括AML和ALL）中ERG和MN1基因的表达水平及不同FAB亚型患者中两基因表达水平的差异。3、探讨AL不同染色体核型、临床特征及免疫表型与ERG和MN1 mRNA表达水平的关系;4、分析ERG基因和MN1基因两者表达水平之间的关系及其与AL疗效和预后的关系。方法:1、培养KASUMI-1细胞,提取总RNA,选用GAPDH为内参基因,针对ERG、MN1及GAPDH mRNA设计引物,RT-PCR扩增目标片断,PCR产物纯化后转化到T载体,构建含目标片段的质粒,做为阳性定量标准模板的克隆。2、克隆的阳性定量标准模板按10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²,10¹copies/μl梯度稀释,在荧光定量PCR仪分别进行PCR反应,得到标准曲线并验证该方法的灵敏性和重复性,同时验证ERG、MN1、GAPDH三者扩增效率是否一致。3、研究对象:经细胞形态学、组织化学染色及流式细胞术免疫学分型确诊的87例初治AML患者及80例初治ALL患者。16名非恶性血液疾病患者骨髓标本为试验对照组,其中特发性血小板紫癜患者9名,缺铁性贫血患者7名。4、提取AL及对照组患者骨髓标本,提取总RNA,逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测。每份标本均进行3个重复检测,最后CT值取其均数。为排除RNA浓度对扩增效率的影响,ERG和MN1 mRNA表达水平采用的相对表达量来表示,即采用2^-ΔCT值(ΔCT=ERG/MN1-GAPDH;2^ΔCT=2^{GAPDH-ERG/MN1})来表示ERG和MN1的相对表达量,并分析ERG和MN1表达水平与FAB分型、核型、免疫表型、临床特征、疗效和预后关系。5、利用SPSS 13.0软件统计分析数据。两组计量资料间分布比较用Mann-whitney U test;两组以上计量资料间分布比较用Kruskal-wallis test及Bonferroni test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation test;率的比较采用卡方检验;生存分析采用Kaplan Meier analyses,不同生存曲线间差异采用log-rank test。生存时间的单因素和多因素分析使用Cox Regression。所有检验以P＜0.05为显著统计学差异,双侧检验。结果:1、利用Trizol提取的KASUMI-1细胞的总RNA,经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见28S和18S明显的2条条带,证明抽提的RNA质量完好,无DNA污染。RT-PCR扩增后终产物经2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外线下观察,可看到与目的片段大小一致的69bp（ERG）、92bp（MN1）及225bp（GAPDH）的电泳条带。2、不同梯度标准品模板的对数值与荧光定量PCR扩增的循环数（CT值）之间有着非常好的线性相关关系（r=0.9996,0.997,0.997）。构建的体系灵敏度高达10拷贝/μl,重复性好。ERG、MN1、GAPDH三者扩增曲线的斜率分别为-3.245、-3.182、-3.284;扩增效率分别为95%,97%,98%,说明三者扩增效率基本一致,可以用2^-ΔCT相对定量法进行数据分析。3、87例AML骨髓标本中ERG基因表达量中位数为0.056（0～0.750）,MN1基因表达量中位数为0.047（0～7.731）;16例非恶性血液病患者骨髓标本中ERG基因表达量中位数为0.004（0～0.056）,MN1基因表达量中位数为0.004（0.001～0.014）。AML组ERG基因及MN1基因表达均显著高于正常对照组（Z值分别为-4.379和-5.098;P值均小于0.001）。80例ALL骨髓标本中ERG基因表达量中位数为0.071（0.000～11.174）,MN1基因表达量中位数为0.002（0.000～0.043）;16例非恶性血液病患者骨髓标本中ERG基因表达量中位数为0.004（0～0.056）,MN1基因表达量中位数为0.004（0.001～0.014）。ALL组ERG基因表达显著高于正常对照组（Z=-5.043,P＜0.0001）;而ALL组MN1表达与正常对照组差异无统计学意义（Z=-1.435,P=0.151）。4、AML不同FAB分型间ERG和MN1基因的表达水平的差异无统计学意义（P=0.850和0.870,Kruskal-wallis test）。AML中ERG基因表达水平与外周血白细胞计数（WBC）及血清乳酸脱氢酶（LDH）水平成正相关（Spearman rankcorrelation test、相关系数r_s=0.300,P=0.005;r_s=0.317,P=0.032）,AML中MN1基因表达水平与WBC、LDH无相关性。AML中ERG和MN1基因表达水平与HGB、PLT无明显相关性。在染色体可评估的66例AML患者中,ERG基因的表达水平在不同核型危险组之间存在显著差异,高危核型组ERG表达水平显著高于中低危核型组。而MN1基因在不同核型危险组之间的表达水平差异无统计学意义。CD34、CD117、CD56阴性及阳性AML病例之间ERG和MN1基因的表达水平无显著性差异。ALL中ERG基因表达的水平与WBC、HGB、PLT、LDH水平无明显相关性（P=0.550、0.872、0.868、0.819）。B-ALL患者ERG和MN1基因的表达水平与T-ALL组间的差异无统计学意义（Z=-1.428,P=0.153）。BCR/ABL基因阳性组（18例）ALL ERG基因表达水平与BCR/ABL阴性组（62例）的差异无统计学意义（Z=-0.438,P=0.662）。伴有髓系抗原表达组与未伴有髓系抗原表达组ALL患者之间ERG表达水平无显著差异（Z=-0.721,P=0.471）。5、随访一年的75例初治AML患者,完全缓解（CR）率为77.3%,ERG基因和MN1基因高表达组的CR率与低表达组的比较差异无统计学意义（P值分别为0.968、0.695）;75例可随访的AML中一年内有27例复发,复发率为36.0%。其中ERG基因高表达组一年复发率显著高于ERG低表达组（P=0.039）;MN1高表达组一年复发率与低表达组的差异无统计学意义。将两基因的表达水平及临床特征对30例正常核型AML生存时间的影响使用Cox回归模型进行单因素及多因素分析,发现ERG表达水平对正常核型AML患者的生存时间有影响。使用Kaplan Meier analyses方法对30例正常核型患者中的ERG高表达组（8例）及ERG低表达组（22例）进行生存分析,发现ERG高表达组生存时间显著短于低表达组（χ²=7.750,P=0.005）。联合检测两个基因表达水平与AML预后关系显示ERG和/或MN1基因高表达者CR率与ERG和MN1基因均低表达组相比较差异无统计学意义（χ²=0.003,P=0.954）。ERG和/或MN1基因高表达组复发率显著高于ERG和MN1均低表达组（χ²=4.748,P=0.029）。使用Kaplan Meier analyses方法对30例正常核型患者进行生存分析显示ERG高表达和/或MN1高表达组的总生存时间显著短于ERG和MN1均低表达组（χ²=4.080,P=0.043）。6.在可随访的63例ALL中,初治完全缓解（CR）率为68.3%（43例）,ERG基因高表达组的CR率与低表达组的差异无统计学意义（χ²=0.673,P=0.412）。63例可随访的ALL中一年内有23例复发,复发率为36.5%。其中ERG基因高表达组复发率与ERG低表达比较差异也无统计学意义（χ²=3.048,P=0.081）。将两基因的表达水平及临床特征对ALL生存时间的影响使用Cox回归模型进行单因素分析,发现ERG表达量对ALL患者的生存有影响。使用Kaplan Meier analyses方法对63例ALL患者进行生存分析结果显示ERG高表达组一年总生存时间显著短于ERG低表达组（P=0.033）。结论:1、成功构建了荧光定量PCR检测ERG和MN1 mRNA表达水平的方法。2、AML患者ERG和MN1基因表达水平显著高于非恶性血液病患者,AML中ERG基因表达水平与MN1基因表达水平未存在相关性。ALL患者ERG基因表达水平显著高于对照组,而ALL患者MN1基因表达水平与对照组比较差异无统计学意义。3、AML患者ERG基因的表达水平与WBC及血清LDH水平存在正相关,高危染色体核型患者中ERG的表达水平显著高于低中危组;AML患者ERG基因的表达水平与FAB亚型及CD34、CD56、CD117抗原是否表达无相关性。AML患者MN1基因表达水平与FAB亚型、血象、临床特征、免疫表型及染色体危险度分层之间均无相关性。ALL中ERG基因表达的水平与血象、LDH水平、BCR/ABL及是否伴髓系抗原表达均无相关性。4、AML中ERG基因高表达组一年复发率显著高于低表达组、一年OS显著缩短,是AML预后不良的指标,但ERG基因表达水平对初治AML患者CR率无显著影响。本实验显示MN1基因表达水平对AML的CR率、一年复发率及OS无显著影响。ALL中ERG基因高表达组一年OS显著缩短,但与CR率及一年复发率无显著影响。5、Cox回归模型表明ERG高表达是影响AML和ALL的独立的预后因素。6、联合检测ERG和MN1基因表达水平对AML预后的指导意义并不明显优于仅检测单个ERG基因表达水平。