磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)广泛存在于各种真核细胞的胞膜中，并主要分布于细胞膜靠近胞浆的内侧面。PIP2虽然占细胞膜质脂的含量很少(不到1％)，但却作为细胞信号转导过程中关键的调节因子，在包括产生胞内第二信使、胞吐与胞饮调控、细胞骨架与胞膜贴附等一系列细胞的生理过程及生命活动中发挥着重要作用。 PIP2是细胞信号转导通路中的关键调节因子，经磷脂酶C(PLC)水解后可生成DAG及IP3，二者可作为第二信使，分别激活PKC与促使细胞内钙库释钙。目前越来越多的证据表明，PIP2虽为信号通路中的上游分子，其本身亦作为一种重要调节因子，参与了包括N型钙通道、多种电压依赖性钾通道(Kir，KCNQ等)的功能调控。 M通道电流作为一种慢激活、非失活的电压依赖型外向钾离子电流，因其可被毒蕈碱受体(M受体)激活后所抑制，所以由此而得名。在Brown和Adams首次在牛蛙颈上交感神经节发现M电流后的近25年的时间里，人们对其调节机制作了大量研究，已经发现众多与Gq蛋白偶联的受体激活后能引起M电流的抑制，信号通路的许多下游分子，包括PKC、AKAP150、CaM、钙离子、花生四烯酸及代谢产物等均被证实参与了受体介导的M电流抑制过程，但是其确切的调节机制还是不得而知。M电流的抑制将导致神经系统兴奋性升高。而M通道功能失调与良性家族性新生儿惊厥症(BFNCs)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer)、癫痫等疾病有密切关系。最近的研究表明，PIP2本身可以直接激活M电流，而其水解则是受体介导的M电流抑制的原因之一。PIP2水解后所引发钙离子释放则被证实在某些受体发挥对M电流的调节中必不可少。 本实验将以爪蟾卵母细胞、HEK293细胞及几种类型神经元为研究对象，观察不同Gq蛋白偶联受体激活后引起的PIP2水解与内钙释放关系，进而研究这两种因素在M通道调节过程中发挥的作用。 一、在表达系统中观察细胞膜磷脂PIP2水解与细胞内钙释放的关系 目的：研究卵母细胞中外源性表达的M1受体及BK2受体激活后究竟是否引发细胞膜PIP2水解与胞内钙升高，并探讨二者关系。此外，利用另一表达系统-HEK293细胞，继续探讨上述过程的机制。 结论：(1)M1受体、BK2受体激活后可诱导出卵母细胞自身表达的钙激活氯通道电流，提示细胞内钙有升高，且这种内钙升高绝大部分来自于卵母细胞内质网钙库钙释放。(2)可以利用激光扫描共聚焦显微镜对卵母细胞内钙升高进行观察。M1受体、BK2受体激活后均引起钙波在胞内的扩布。(3)表达于卵母细胞的M1受体激活后，可引发卵母细胞膜的PIP2水解。PIP2水解与内钙释放的发生在时间上密切相关。(4)HEK293细胞所表达的M1受体、BK2受体激活后均可引起细胞膜PIP2水解与内钙升高，且二者的发生在时间上密切相关。 二、几种Gq蛋白偶联受体激动剂引发不同神经细胞内钙释放作用的研究 目的：比较Gq蛋白相偶联的M1，H1，angiotensinⅡ，BK2，P2Y受体激活后引发神经细胞内钙释放的作用。 结论：Oxo-M，bradykinin，angiotensinⅡ，histamine，激活同种神经细胞中Gq蛋白偶联的相应受体后，引发细胞内钙释放的作用之间存在着明显不同，而且相同受体在不同类型神经细胞中被激活后也会产生不同现象。钙离子作为一种重要的第二信使参与细胞的许多调节过程，细胞内钙离子的不同变化，必然导致下游信号转导通路的不同。这将对解释神经递质与激素作用的多样性具有重要意义。 三、组胺(histamine)对大鼠颈上神经节M电流的调节目的：研究组胺对原代细胞M通道电流的调节机制，探讨其调节作用与胞内钙释放的内在关系。 方法：(1)采用全细胞膜片钳记录法，观察组胺对大鼠SCG表达的M电流作用。(2)采用LSCM方法，观察组胺引发大鼠SCG细胞内钙释放的作用。 总结 1.表达于卵母细胞及HEK293细胞上的M1与BK2受体激活后，均能引起细胞内钙升高，生高的钙离子主要来自内钙的释放。HEK293细胞M1与BK2受体激动后，引起胞膜PIP2水解，PIP2水解与内钙释放在时程上一致。卵母细胞M1受体激动后，亦引起胞膜PIP2水解。 2.同为Gq蛋白偶联的不同受体激动后，在同一神经细胞中引发的钙信号存在不同；而在不同类型神经细胞间，同一Gq蛋白偶联受体激活也能引发不同的钙信号。 3.组胺在其生理浓度10μM对大鼠SCG细胞的M电流产生抑制，这种抑制作用是通过激动H1受体，进而激活磷脂酶(PLCβ)引起的。组胺可以引发SCG细胞内钙释放，并伴随大量外钙内流。但组胺的抑制作用并不受内钙螯和的影响。组胺对M电流调节的机制与bradykinin及oxo-M存在不同。